La trascrizione nei procarioti

1. La trascrizione nei procarioti

2. Trascrizione e traduzione sono accoppiate nei procarioti Non appena inizia la trascrizione dell’mRNA, i ribosomi vi si attaccano ed iniziano la sintesi proteica. La traduzione dell’mRNA da parte dei ribosomi inizia non appena la sua estremità 5’ diviene accessibile. Quando il primo ribosoma si sposta dall’estremità 5’, un secondo ribosoma può attaccarsi.

3. Trascrizione (nucleo) e traduzione (citoplasma) sono disaccoppiate negli eucarioti

4. RNA POLIMERASI E’ l’enzima che catalizza la sintesi di RNA. Usando il DNA come stampo, questo enzima polimerizza NTP con legami fosfodiestere da 5’ a 3’.

5. L’RNA polimerasi si lega ad una regione del DNA chiamata PROMOTORE • Il P. si trova a monte del punto di inizio della trascrizione (elemento cis-agente) • Differisce dalle sequenze del DNA trascritte/tradotte e serve come sequenza di riconoscimento da parte di proteine regolatrici (fattore trans-agente) • Il P. batterico possiede due sequenze esameriche consenso distinte, situate a -10 e -35 bp dal punto di inizio della trascrizione

6. L’RNA polimerasi è un OLOENZIMA, costituito da un NUCLEO e da un Fattore s • il Nucleo catalizza la polimerizzazione, ha PM 400 kDa, è composto da 5 subunità: aI, aII, b, b’ e ω. Simile alle chele di granchio. Il legame del fattore s al nucleo produce la chiusura delle pinze e la modificazione del canale interno in cui avviene la trascrizione. Il sito attivo si trova sul retro. • Il Fattore s è coinvolto nel riconoscimento dei promotori dei geni; in comune 4 regioni di omologia aminoacidica, ciascuna suddivisa in sottodomini con funzioni specifiche. Fra i più abbondanti il s70, che si lega alla maggior parte dei promotori di E. Coli. Fattore s Nucleo Nucleo + Fattore s

7. Fattori sigma alternativi di E. Coli

8. La Trascrizione si articola in tre fasi: • Inizio • Formazione di un complesso del promotore chiuso • Formazione di un complesso del promotore aperto • Clearance del promotore • Allungamento • Terminazione

9. INIZIO 1) Con l’aiuto del fattore s, il nucleo dell’RNA pol si lega al promotore in un complesso chiuso, in cui i filamenti del DNA sono appaiati. Questa fase è reversibile. 2) L’oloenzima separa i filamenti del DNA intorno al sito di inizio della trascrizione, creando il “complesso aperto”. Si osservi un nucleotide NTP in ingresso. Questa fase è generalmente irreversibile. 3) Durante il passaggio della clearance del promotore, l’RNA pol inizia la trascrizione e si sposta dal promotore. Si ha uno spostamento sequenziale di alcuni domini del fattore s che altrimenti ostacolerebbero l’estensione della nascente catena di RNA. Le porzioni spostate comprendono la regione 3.2 e la regione 4.

10. ALLUNGAMENTO L’allungamento ha inizio dopo che sono stati sintetizzati 9-12 nt. La transizione è segnata da un cambiamento conformazionale nel nucleo dell’enzima. Mentre si muove, l’RNA pol mantiene separati i filamenti di DNA formando la “bolla” di trascrizione, man mano che li svolge davanti a sé per poi riavvolgerli. All’interno della bolla, un filamento di DNA agisce da stampo per la sintesi di RNA. Il sito catalitico dell’enzima è costituito da un sottosito di legame del substrato (per il successivo NTP), e da un sottosito di legame del prodotto (per l’estremità 3’ del nascente filamento di RNA). Dall’NTP viene rimosso un pirofosfato e si forma un legame fosfodiestere con il gruppo 3’-OH dell’ultimo nucleotide della catena di RNA (il verso, come nella replicazione del DNA, è sempre 5’->3’).

11. TERMINAZIONE Due tipi di terminatori riconosciuti dall’RNA pol: Terminazione Rho-indipendente Sono caratterizzati da una sequenza consenso costituita da una ripetizione inversa che può formare una struttura stelo-ansa appena prima dell’ultima base trascritta, in grado di destabilizzare la bolla provocandone il collasso. La sequenza ripetuta invertita è seguita da 7-8 nt contenenti uracile. L’elica ibrida RNA/DNA composta da coppie UA è meno stabile di altre coppie (GC, CG, AT). Questa combininazione contribuisce a terminare la trascrizione. Terminazione Rho-dipendente E’ controllata dalla capacità della proteina Rho di accedere all’RNA. Rho è una proteina esamerica a forma di anello che si lega all’estremità 5’ dell’RNA in un sito ricco in C (Rho utilization site, rut). Il temporaneo rilascio di una subunità dell’esamero permette al segmento 3’ del trascritto nascente di entrare nel canale centrale dell’anello di Rho. Rho scorre quindi lungo l’RNA “dando la caccia” all’RNA pol: quando questa si ferma sulla struttura stelo-ansa, Rho può raggiungerla e svolgere il debole ibrido DNA/RNA. Ciò provoca la terminazione della sintesi dell’RNA ed il rilascio di tutti i componenti,

12. CORREZIONE DELLE BOZZE DA PARTE DELL’RNA POLIMERASI Durante l’allungamento, l’RNA pol si muove sul DNA polimerizzando una catena di RNA. L’enzima, che è dotato di attività di proof-reading, può in qualsiasi momento scorrere indietro lungo lo stampo, provocando una pausa temporanea della trascrizione. A questo punto l’RNA pol può scorrere di nuovo in avanti e far procedere la trascrizione (sin) oppure rimuovere nucleotidi di RNA male appaiati (dx).

13. REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA Il modello dell’operone di Jacob e Monod per il controllo della sintesi degli enzimi che metabolizzano gli zuccheri prevede l’esistenza di un repressore, prodotto da un gene regolatore (R) che si lega ad un sito operatore (O), bloccando l’espressione di geni strutturali (A, B) che si trovano a valle del sito operatore. Il repressore può legarsi anche ad un induttore (metabolita), che diminuisce l’affinità del repressore stesso per l’operatore e permette l’espressione dei geni strutturali. Il modello ipotizzava l’esistenza di un intermedio di RNA (mRNA) nella sintesi proteica.

14. Regolazione dell’operone lac da parte di glucosio e lattosio • Struttura dell’operone lac: • I: gene repressore, che codifica per il repressore Lac • Pi: promotore del gene I • O: operatore lac, a cui si lega il repressore Lac • +1: sito di inizio della trascrizione • CAP: sito di legame per la proteina attivatrice CAP • Plac: promotore lac (controlla l’espressione dei geni strutturali) • lacZ: codifica per la b-galattosidasi (enzima che cliva il lattosio in galattosio e glucosio) • lacY: codifica per la lattosio permeasi (proteina che fa parte del sistema di trasporto dei b-galattosidi nella cellula) • lacA: codifica per una transacetilasi che libera la cellula dai tiogalattosidi tossici. • Mutazioni a carico di lacZ e lacY impediscono alle cellule di metabolizzare il lattosio, mentre mutanti lacA possono ancora usare questo zucchero. • Trascrizione dell’operone lac • La trascrizione dell’operone lac viene repressa in assenza di lattosio, indipendentemente dalla mancanza (B) o dalla presenza di glucosio (C). In entrambe le condizioni, il repressore proteico Lac si lega all’operatore impedendo l’accesso all’RNA pol. • In presenza di glucosio e lattosio (D), l’RNA pol si lega debolmente al promotore lac, producendo un livello basale di trascrizione dei geni strutturali. • Quando è presente solo il lattosio (E), l’operone lac viene indotto: il legame di un induttore (allolattosio) cambia la conformazione del repressore Lac e ne altera il dominio di legame con l’operatore. A questo punto, la proteina CAP, insieme al cAMP, recluta l’RNA pol e si lega sul sito CAP stimolando di 20-40 volte la trascrizione. I geni strutturali vengono infine trascritti come mRNA policistronico.

15. STRUTTURE DEL LATTOSIO, ALLOLATTOSIO ED IPTG La b-galattosidasi catalizza la scissione del lattosio in galattosio e glucosio. Una reazione collaterale converte il lattosio nell’induttore allolattosio (cambiamento del legame galattosidico da b- 1,4 a b- 1,6). La b-gal non può metabolizzare un analogo del lattosio (IPTG) contenente zolfo, usato in biologia molecolare per indurre l’espressione dei geni che sono sotto il controllo dell’operone lac.

16. Attenuazione trascrizionale dell’operone del triptofano • La regolazione dell’operone del triptofano nei batteri è un classico esempio di attenuazione trascrizionale. • Durante la trascrizione della regione leader dell’operone del triptofano (trp), un dominio del trascritto di RNA appena sintetizzato si può ripiegare per formare due diverse strutture a forcina in competizione fra loro, terminatore ed antiterminatore. L’RNA leader che precede l’antiterminatore contiene una regione codificante di 14 nt, trpL, che include due codoni del triptofano. • Terminazione: si verifica quando le cellule hanno adeguati livelli di tRNATrp per la sintesi proteica; in questo caso viene sintetizzato il peptide leader (trpL), nel trascritto leader si forma la struttura a forcina del terminatore, e la trascrizione viene bloccata. • Antiterminazione: si verifica quando i livelli cellulari di tRNATrp sono scarsi; in questo caso, il ribosoma che traduce il trpL si blocca a livello di uno dei due codoni del triptofano. Questo stallo consente alla sequenza a valle di ripiegarsi, formando la struttura dell’antiterminatore, che impedisce la formazione del terminatore (con cui compete). La trascrizione dei geni strutturali da parte dell’RNA pol può dunque proseguire.

17. Repressione dell’operone del triptofano mediata da proteina L’inizio della trascrizione dell’operone del trp è controllato anche da sistemi più convenzionali. Un repressore dimerico attivato da triptofano si lega a siti operatori posti nella regione del promotore trp, bloccando l’accesso dell’RNA pol al promotore trp.