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TRANSFECCIONES Maestría en Biología Molecular Médica 2006

TRANSFECCIONES Maestría en Biología Molecular Médica 2006. La introducción de DNA en las células procariontes y levaduras se llama Transformación La transformación de células eucariontes superiores se refiere a cambios en las características del cultivo celular

giovanna
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TRANSFECCIONES Maestría en Biología Molecular Médica 2006

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Presentation Transcript

  1. TRANSFECCIONES Maestría en Biología Molecular Médica 2006

  2. La introducción de DNA en las células procariontes y levaduras se llama Transformación • La transformación de células eucariontes superiores se refiere a cambios en las características del cultivo celular • Por ello se utiliza el término transfección para denominar la entrada de DNA foráneo a la célula

  3. Fibroblastos humanos COS

  4. Cultivos celulares • Cultivos primarios • Lineas celulares establecidas Por transformación con oncogenes Provenientes de tumores

  5. Curva de cultivos celulares Germinales (telomerasa activa) TRF Somáticas (telómeros se acortan telomerasa inactiva) Células inmortales (tel.activa) Extensión de la vida celular senecencia crisis Divisiones celulares

  6. TRANSFECCIONES • OBJETIVOS • Expresión de proteínas para su purificacón • Expresión de proteínas para estudiar su efecto sobre el fenotipo celular • Estudio de promotores y elementos regulatorios • Estudio de mecanismos involucrados en el procesamiento del RNA, postraduccionales, etc. • Interacción de proteínas • Clonado • Terapia génica

  7. Problemas que pueden surgir de expresar proteínas en sistemas procariontes • Inestabilidad • Sin actividad biológica • Contaminantes procariontes • Características bioquímicas diferentes

  8. Modificaciones postraduccionales imcompletas o ausentes • Clivaje proteolítico • Glicosilación • Alteraciones de los aminoácidos • fosforilación • acetilación • Sulfatación • Adición de ácidos grasos

  9. Métodos de Transfección Depende del tipo celularHeLa, HEK 293T, COS7, Liposomas alta eficiencia, no-tóxicoe.g. Lipofectamine Plus (Invitrogen), Tfx20 (Promega) Fosfato de calcio simple, baja eficiencia DEAE-dextrano simple, alta efficiency, no para estable Electroporación alta eficiencia, altos niveles de muerte Microinyección laborioso, alta eficiencia Biobalística para células vegetales Retrovirus muy eficiente, trabajoso

  10. Liposomas: mezcla Moléculas lipídica catiónicas (N,N,N´,N´-tetramethyl-N,N´-bis(2-hydoxyethyl)-2,3-di(oleoyloxy)-1,4-butane-diammonium iodide) Y de un lípido neutro L-dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE).

  11. Electroporación

  12. Electroporación para células pegadas

  13. Biobalística

  14. Microinyección

  15. Métodos de transfección

  16. Vectores de expresión eucariontes • Elementos para clonado en bacterias • ori de replicación • Marcador de selección bacteriano • Sitios múltiples de clonado

  17. Elementos específicos de vectores eucariontes _ Promotor eucarionte • Señal de poliadenilación • Secuencias Kozak y codón ATG • Intrón • Tags-proteínas de fusión • ori de replicación eucarionte como el de SV40 (opcional) • Marcador de selección para células eucariontes (para transfecciones estables) • Segmentos de DNA para recombinación homóloga

  18. Vector de expresión eucarionte

  19. Promotores eucariontes Constitutivos: • SV40 • RSV • CMV • hEF-1a • Ubc Inducibles: • Tet o T-Rex inducilbe por tetraciclina • Olac inducible por IPTG • Metalotioneína inducible por metales pesados • GAL4-E1b inducible por mifepristona

  20. Tags • Glutation-S-transferasa • His • V5 • Hemoaglutinina (HA) • Myc • Flag • EGFP

  21. Elementos de control de la traducción Región transcribible del gen 5’ leader 1 2 3 4 gen de interés 5 3’ trailer • 1AUG (secuencia Kozak = CCRCCAUGG) • 2 Secuencia señal de secreción • 3 Tag para su purificación • Sitio de clivaje proteolítico • Señal de poliadenilación

  22. Transfección transiente • (48-72 horas) • Análisis rápido • Múltiples propósitos • Análisis de secuencias regulatorias

  23. Vector de expresión

  24. Vector de expresión

  25. Proteínas producidas en cultivos de células eucariontes • Proteína Condición • Factor IX & VIIIc hemophiliacs • CD4 receptor AIDS • erythropoetin cancer • b & g interferons cancer • Interleukin-2 cancer • growth hormone dwarfism • tissue plasminogen activator heart attack/stroke • Hepatitis B surface antigen vaccine • monoclonal antibodies various

  26. Vector de fusión a EGFP

  27. Vector de fusión a ZsYellow

  28. Expresión de proteínas fluorescentes Proteína fluorescente verde

  29. Vector de anclaje a membrana de la proteína

  30. Vector de secreción de la proteína

  31. Dos vectores de expresión diferentes • El número de copias de cada plásmido puede ser diferente • La expresión de cada proteína puede ser diferente

  32. Vectores que expresan dos genes • Cada gen es una unidad transcripcional y tiene su promotor y secuencia de poliadenilación • Pueden no expresar la misma cantidad de protína

  33. Vectores dicistrónicos • Posee un solo promotor • 2 genes a partir de la misma unidad transcripcional • Se sintetiza un solo mRNA • Necesita un sitio interno de unión al ribosoma • IRES proviene del genoma de virus de mamíferos

  34. Vectores dicistrónicos

  35. 5’ 3’ PROMOTOR exón 1 intrón exón 2 transcripción Gen reportero para análisis de promotores 5’ 3’ mRNA AAAAAA m7GpppN La mayoría de los cambios en los niveles de mRNA ocurren por variaciones en la transcripción. ANALISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA

  36. 5’ 3’ PROMOTOR exón 1 intrón exón 2 PROMOTOR GEN REPORTEROe.g. luciferasa Estrategia de genes reporteros Los genes reporteros son secuencias que codifican para proteínas de simple detección. Se usan para reemplazar productos génicos difíciles de medir y determinar actividad promotora.

  37. Genes reporteros CAT (cloramfenicol acetiltransferasa)Transfiere grupos acetilos marcados 14C o 3H al cloramfenicol.La detección se da por cromatografía en capa delgada o extracción orgánica GAL (-galactosidasa)Hidroliza sustrato incoloro (ONPG) para dar producto amarillo que se cuantifica SEAP (secreted human placental alkaline phosphatase)Ensayo de fosfatasa alcalina bioluminiscente. Muy sensible LUC (luciferasa)Oxida a la luciferina emitiendo fotones. Los fotones se cuentan en un luminómetro o una cámara de recuento de fotones (ensayo in vivo). Hay diferentes luciferasas dispoinibles GFP (green fluorescent protein)Fluoresce por irradiación con UV – se observa con microscopio de fluorescencia.

  38. Vector para analizar secuencias promotoras.

  39. Vector para analizar secuencias promotoras.

  40. Vector control-secuencias regulatorias

  41. Vector control-secuencias regulatorias

  42. Gen reportero (ej luciferasa) Ensayo de genes reporteros Diseño y construcción del vector Introducción en células por transfección transiente o estable Ensayo de actividad Gen control (ej b-galactosidasa) Cálculo de actividad promotora

  43. Vector control de eficiencia de transformación

  44. Vector control de eficiencia de transformación

  45. Co-transfección de genes reporterosDual Luciferase Assay system - Promega Se clona el promotor de interés delante del gen de luciferasa (firefly) y se usa la luciferasa de Renilla como control interno La luciferasa de Renilla se expresa de un promotor constitutivoe.g. SV40 I/E HSV TK

  46. Ejemplo de resultado

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