Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 1. Úvod

1. Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 1. Úvod Petr Koutecký & Jiří Košnar, 2013 Vytvořeno v rámci projektu Molekularizace biologických oborů PřF JU reg. č. CZ.1.07/2.2.00/15.0364

2. Přehled témat • Úvod (základní pojmy, typy markerů, variabilita, apod.) • Isozymy • Izolace DNA • PCR • Přímé sekvenování • NGS (next generation sequencing) • Metody s arbitrárními primery (RAPD, ISSR) • Mikrosatelity (SSR) • Restrikční metody (RFLP, PCR-RFLP, T-RFLP) • AFLP ke každé metodě technický princip, struktura a vyhodnocení dat, příklady použití v botanice

3. Úvod Co jsou markery? = znaky, v širším smyslu jsou markery např. morfologické, cytologické, chemické ... Co jsou molekulární markery? = ty, které odrážejí molekulární podstatu genetické informace; variabilita je generována mutacemi a přestavbami genomu: • DNA metody – pracují s variabilitou na úrovní DNA • konkrétní sekvence • délková variabilita fragmentů DNA (elektroforéza apod.) • proteiny, isozymy – variabilita odvozená ze struktury DNA • organizace DNA na cytogenetické úrovni (FISH, GISH,...) • příp. další, jako charakteristiky biosyntetických drah apod.

4. Úvod sekvence DNA ► přepis do RNA a následně do proteinů ▲ nepřímá informace: variabilita ELFO mobility (= hlavně délky) molekul - fragmentů DNA banding pattern ▲ nepřímá informace: variabilita ELFO mobility (délka, elektrický náboj) molekul proteinů

5. Aplikace molekulárních markerů Taxonomie vedle dalších znaků do datové matice také informace o vztazích mezi taxony, reprodukčních bariérách, genetické variabilitě taxonů... Populační biologie studium genetické variability populací a faktorů ji ovlivňujících (inbreeding, gen. drift, migrace,…); podíl pohlavního / nepohlavního rozmnožování; identifikace klonů; v širším geografickém měřítku migrace a refugia (fylogeografie) Ekologie společenstev od prosté základní identifikace organismů (barcoding) i z fragmentárních vzorků, až ke komplexní analýze složení daného společenstva – např. mikroorganismů nebo hub, které často nelze zkoumat pomocí klasické morfologické determinace (+ aplikace v biotechnologiích, identifikace kultivarů v zemědělství apod.)

6. Výhody a omezení • Výhody molekulárních markerů • nejsou ovlivněny vnějším prostředím (není fenotypová plasticita) • teoreticky téměř neomezený počet znaků • měly by být více variabilní než ostatní markery • velmi výhodný zdroj dat pro taxony s obtížně detekovatelnou morfologickou variabilitou (např. mikroorganismy) • někdy velmi rychlá evoluce → možnost detekovat recentní procesy

7. AAGGTA (předek) AAGATA AAGCTA AAGTTA AAGTTA Bird Bat stejná ELFO mobilita, ale odlišná sekvence: ATCTCATCCTTGATTA Výhody a omezení • Nevýhody molekulárních markerů: • Mají stejnou hlavní nevýhodou jako kterýkoli jiný typ dat: homoplazie, i když obvykle v menší míře homoplazie = stejný stav znaku, který u 2 nebo více studovaných jedinců vznikl nezávisle; zdánlivá podobnost, která ale neodráží příbuznost (morfologická homoplazie) (homoplazie na úrovni sekvence DNA) (homoplazie DNA fragmentu)

8. Výhody a omezení • Nevýhody molekulárních markerů: • pro některé typy markerů je nutná určitá předběžná znalost genomu studovaného organismu • krajním případem jsou specifické markery, které fungují jenom na danou taxonomickou skupinu (např. rod) • potřebné informace často nejsou k dispozici • drahé / pracné je získat de novo • stále relativně vysoká cena molekulárních analýz • potřeba speciálně vybavené laboratoře

9. Variabilita • Jak variabilní marker potřebujeme? • „tak akorát“ – pokud možno co nejvyšší variabilita odlišující studované skupiny (populace / taxony) nebo odhalující určitý jev + zároveň co nejnižší „nevysvětlená“ variabilita • málo variabiliní marker nenese dost informace • pozor na příliš variabilní markery (viz dále) • marker vhodný pro jednu skupinu organismů na dané taxonomické úrovni může být zcela nevhodný pro jinou skupinu na téže úrovni • ale může být výhodný na jiné úrovni • genetická variabilita může souviset s typem rozmnožování (viz dále)

10. Variabilita • Příliš variabilní markery • obvykle nelze použít totéž na různých taxonomických úrovních • co dobře funguje mezi populacemi může být příliš variabilní mezi druhy / rody, a naopak • zvýšené riziko homoplazií • mutace se ”protočí” a stejný stav znaku vznikne nezávisle u nepříbuzných jedinců • předpoklad homologie srovnávaných znaků je kritický, bez jeho splnění nemá většina analýz smysl

11. ◄ ◄ ◄ Variabilita Příklady problémů u příliš variabilních markerů: Nejistá homologie bází v evolučně příliš vzdálených sekvencích DNA: (shoda bází může být čistě náhodná, nelze z ní odhadovat homologii) ISSR banding pattern dvou odlišných druhů r. Schoenoplectus: - oba druhy značně odlišné - málo sdílených lokusů - i u několika málo potenciálně sdílených bandů (◄) není jistota homologie

12. ▲ 8 lokusů, metoda ISSR Lokus, multilokusová data • Lokus • konkrétní místo v genomu (konkrétní gen / sekvence; určité místo na daném chromosomu;…) • srovnáváme data v rámci 1 lokusu • jinak není homologie • vždy je výhodné mít co nejvíc data z různých míst genomu (lokusů) • Multilokusová data • některé markery poskytují informacez více lokusů najednou – většinaDNA metod vytvářejících tzv. banding pattern • trochu definice kruhem: lokus = fragment dané délky • u ostatních markerů (isozymy, sekvenování) je možné získat data z více lokusů, ale za cenu vyšších nákladů

13. 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 AB AA BB BB BC CC AB CC BC Dominantní a kodominantní data Dominantní data = jsme schopni rozlišit pouze přítomnost / nepřítomnost (dominantní homozygot a heterozygot vypadají stejně) • kódování 0 / 1 • typicky ISSR, AFLP • často multilokusová data Kodominatní data = jsme schopni rozlišit i heterozygoty • allozymy, mikrosatelity, PCR-RFLP, někdy sekvence • pro populační genetiku výhodná kodominantní data • často ale stačí i dominantní data (příbuznost / fylogeneze, míra genetické podobnosti, identifikace klonů, …)

14. Selekční neutralita • úspěšnost (fitness) jedince není ovlivněna (ne)přítomností konkrétní alely pro daný lokus; frekvence alel v čase se mění náhodně • nutná pro studium náhodných procesů v populační genetice • genetický drift (včetně founder effect apod.) • migrace (genový tok) • mutační rychlost • typicky nekódující úseky DNA, omezeně isozymy

15. Tři genomy jaderný genom: biparentální přenos + rekombinace možnost polyploidie chloroplastový genom (cpDNA): maternální přenos (u nahosemenných paternální!) v buňce velké množství kopií mitochondriální genom (mtDNA): maternální přenos v buňce velké množství kopií

16. Tři genomy • jaderný • biparentální přenos = semena + pyl • chloroplastový • maternální přenos = pouze semena • pouze u nahosemenných paternální = pyl • mitochondriální • maternální přenos • u rostlin obvykle ale nepoužitelný (malá variabilita, někdy přestavby, výměna genů s jádrem,…) • výjimkou jsou nahosemenné • výhodné kombinovat jádro + chloroplast (→ fylogeografie)

17. Specifita markerů • nespecifické markery • do značné míry univerzální, lze je použít pro řadu taxonů • specifické markery • fungují pouze na daný taxon (příp. blízké příbuzné) • lze je použít, pouze pokud máme pro daný taxon informaci o genomu nutnou pro vlastní provedení metody • v reálu použijeme markery, které pro daný taxon už někdo vyvinul a publikoval, příp. optimalizval nebo musíme vyvinout vlastní markery (časově a finančně náročnější)

18. Specifita markerů • specifické markery je nutné použít, pokud pracujeme se vzorky obsahující tkáně dalších organismů, které potřebujeme z analýzy odfiltrovat (endosymbionti, parazitiapod.) • … a nebo je naopak chceme selektivně zkoumat ▲ hyfy mykorhizních hub (AMF) v kořenech ▲ fykobiont lišejníků

19. Další pojmy • DNA fingerprinting (DNA typing, DNA profiling) • termín používaný spíše ve forenzní genetice • souhrnné označení metod vytvářejících „DNA profil“, podle kterého lze identifikovat daného jedince • hypervariabilní markery • DNA barcoding • určování organismů podle sekvence DNA („čárový kód“) • izoláty z půdy, hyfy hub z kořenů, pozůstatky potravy ve střevech / trusu zvířat,… • běžně neurčitelný materiál – larvy a jiní nedospělci, zbytky mrtvých jedinců, kořeny, morfologicky neodlišitelné druhy,… • variabilní, snadno amplifikovatelné úseky DNA • mitochondriální gen pro cytochromoxidasu (cox) u zvířat • ITS úsek jaderné ribosomální DNA u rostlin

20. Co je dobré vědět dopředu Ploidní stupeň • Polyploidie častá u rostlin (vč. mechorostů), u některých řas • neopolyploidie vs. paleopolyploidie • Stupeň ploidie = počet kopií chromosomů / genů v genomu • Někdy celé komplexy cytotypů / taxonů různých stupňů, retikulátní evoluce • příklad: Achillea millefolium agg. (2n = 2x, 4x, 6x, 8x) • Zásadní informace při vyhodnocování dat! • Jak se zjišťuje – viz samostatná přednáška

21. Co je dobré vědět dopředu Ploidní stupeň • Více typů heterozygotů (→ kodominantní markery) • AAAB, AABB, ABBB • až x alel v jednom genomu (x = počet kopií) • Odhad míry heterozygotnosti jiný než u diploidů • míry genetické vzdálenosti • nesrovnatelné hodnoty mezi ploidiemi (platí i pro další parametry založené na míře heterozygotnosti) • Některé výpočetní postupy předpokládají diploidy, resp. neumí pracovat s více ploidiemi zároveň • populační genetika (F-statistiky, H-W rovnováha,…) • STRUCTURE

22. Co je dobré vědět dopředu Vegetativní rozmnožování • Co je jedinec? • Pozor při sběru vzorků! • a co teprve mikroorganismy … http://alpandino.org/en/course/19/19e.htm

23. Co je dobré vědět dopředu Reprodukční systémy • 3 hlavní způsoby tvorby semen • sexualita – allogamie • sexualita – autogamie • apomixie • zásadní vliv na očekávanou genetickou variabilitu(vnitro- i mezipopulační) • nutno brát v úvahu již při sběru vzorků • smysluplný počet populací a počet jedinců na populaci je různý • … nebo to naopak může být cílem studia (na základě pozorované variability v „náhodném“ vzorku)

24. Co je dobré vědět dopředu Reprodukční systémy vlastnost allogamie autogamie apomixie meiosa, ano ano ne rekombinace identita s ne ne (ale homo- ano rodiči zygotní linie) vnitropopul. velká menší ± žádná variabilita (homozyg. linie) mezipopul. malá n. spíše velká velká (nebo variabilita velká někdy žádná) heterozygo- různá malá často velká sita (hl. u diploidů) (allopolyploidi)

25. Co je dobré vědět dopředu Reprodukční systémy počet vzorků allogamie autogamie apomixie populace méně více více jedinci v více méně málo populaci • … a aby toho nebylo málo, spousta druhů má směs: • různý podíl auto- a allogamie • fakultativní apomixie • … a ke všemu vegetativní rozmnožování