10. SZEMINÁRIUM

1. 10. SZEMINÁRIUM AZ IMMUNKOMPETENS SEJTEK ELVÁLASZTÁSA ÉS AKTIVITÁSUK MÉRÉSE

2. SEJTSZEPARÁLÁS Számunkra érdekes sejteket fizikailag elkülönítjük egy heterogén populáció többi tagjától A sejtek fizikai, biológiai vagy immunológiai különbözőségeit használjuk ki. (A sejtfelszíni markerek kifejeződésének mértékében is gyakori a különbség – lehetőség van a szeparált élő sejtek további vizsgálatára). • fizikai – sűrűség, méret • sejtbiológiai – adherencia, fagocitózis, érzékenység a közegre • immunológiai – eltérő sejtfelszíni antigének A szeparálás eredményességét jelzi:tisztaság, visszanyerés hatékonysága, sejtek életképessége

3. KÉTFÉLE SZEPARÁLÁSI STRATÉGIA Pozitív szeparálás Negatív szeparálás a nem kívánatos sejtek megjelölése és megszabadulás tőlük A szeparálandó sejtet csak a procedúra egyéb körülményei befolyásolják. Funkcionális vizsgálatok esetén inkább ezt használják. elkülöníteni kívánt sejtek megjelölése és elkülönítése a többitőlpl. a sejtek valamelyik sejtfelszíni molekuláját (CD markerét) fluoreszcens ellenanyaggal jelöljük A sejteket a szeparálási folyamat körülményei mellett a receptorához kötött ellenanyag direkt módon befolyásolhatja. A pozitív szeparáció viszont gyakran nagyobb tisztaságot eredményez.

4. Perifériás vér (vagy buffycoat) centrifugálás plazma Mononukleáris sejtek (PBMC) ficoll Neutrofil granulociták Szeparált sejtek Sejtek pipettázása a Ficollra Vörösvértestek FICOLL-PAQUESŰRŰSÉG ALAPÚ SEJTSZEPARÁCIÓ Mononukleáris sejteket tartalmazó „gyűrű” átpipettázása egy másik csőbe, hogy megszabaduljunk a Ficoll-tól

5. (fromGooglepictures) (NatureProtocols http://www.nature.com/nprot/journal/v3/n6/images/nprot.2008.69-F1.jpg)

6. Paramágneses szemcse A SEJTEK IMMUNOLÓGIAI TULAJDONSÁGAIN ALAPULÓ SZEPARÁLÁSI ELJÁRÁSOK Mágneses sejtszeparálás (MACS) Antigén specifikus ellenanyag

7. MÁGNES MÁGNES oszlop Nem jelölt sejtek eltávolítása (negatív szelekció)

8. NKT sejtek NK sejtek limfociták A SEJTEK IMMUNOLÓGIAI TULAJDONSÁGAIN ALAPULÓ SZEPARÁLÁSI ELJÁRÁSOK Fluoreszcens sejtszeparálás (FACS) Például: NKT sejt szeparálás (CD3/CD56) Vér minta T sejtek

9. Az áramlási cella vibrációjának hatására a folyadéksugár a frekvenciától függően, adott stabil helyen cseppekre bomlik cseppleszakadásipont

10. + + + + + + + + + vibráció Lézer Ha a szeparálandó sejt eléri a csepp-képződési pontot, a folyadéksugárra elektromos töltés kapcsolódik (arra a rövid időre), így a leváló csepp töltötté válik. - + - + Elektromosan töltött eltérítő lemezek + Elektromosan töltött eltérítő lemezek + + - + + + + - - - - - - gyűjtőcső gyűjtőcső szemét

11. AZ IMMUNKOMPETENS SEJTEK AKTIVITÁSÁNAK VIZSGÁLATAFAGOCITÁLÓ SEJTEK – FAGOCITÓZIS VIZSGÁLAT • Különböző fluorofórokkaljelöltek elölt patogének alkalmazása (baktériumok: E. coli, S. aureus; élesztő: S. cerevisiae) • A fagocitózis detektálható fluoreszcens mikroszkóppal vagy áramlási citometriával

12. LIMFOCITA AKTIVITÁS MÉRÉSET- és/vagy B-sejtek funkcióját érintő immundeficienciák kimutatására A limfociták specifikus antigénnel történő aktivációja alig detektálható(az antigénspecifikus sejtek száma alacsony) Poliklonálislimfocitaaktivációt kiváltó anyagok segítenek az abnormális limfocita funkciók vizsgálatában

13. HUMÁN T ÉS B SEJTEK POLIKLONÁLIS AKTIVÁCIÓJA • Lektinek (pl.Concanavalin A és PHA) receptorok keresztkötésén keresztül hatnak • Intracelluláris jelátviteli kaszkád aktivátorok(PMA – PKC aktivátor, Ionomycin – emelkedett intracelluláris Ca2+ szint) • Specifikus antitestek (anti-IgM, anti-CD3, anti-TCR)

14. POLIKLONÁLIS B SEJT AKTIVÁTOROK Phytolacca americana Pokeweed (álkörmös) mitogen (PWM) Staphylococcus protein A szuperantigén (SpA) Epstein Barr Vírus (EBV) (transzformáló hatás) Anti-IgM antitest • Canavalia ensiformis • POLIKLONÁLIS T SEJT AKTIVÁTOROK Phytohaemagglutinin(PHA) Concanavalin A (ConA) Anti-CD3, Anti-TCR antitestek Phaseolus vulgaris

15. Receptorok ligand általi keresztkötése (pillanatszerű) Foszforilációs lépések (másodpercek-percek) • Western blot Antigén receptorok (TCR, BCR), citokin receptorok, stb. • Áramlási citometria • Fluoreszcensmikroszkópia i.c. Ca2+emelkedés • qRT-PCR  mRNS • Western blot  fehérje Génaktiváció • i.c. citometria Citokin szintézis • ELISA • ELISPOT Citokin szekréció Limfocita aktiváció A vizsgálat gyakran specifikus antigén-ellenanyag kapcsolódáson alapul Életképesség/apoptózis • halott sejtekre specifikus festékek • 3H-thymidine • CFSE • MTT Sejtosztódás

16. Fluoreszcencia arányos az intracelluláris Ca2+ koncentrációval Fluo-3 vagy Indo-1 sejtaktiváció idő alapjel A CA2+ SZIGNÁL MÉRÉSE ÁRAMLÁSI CITOMETRIÁVAL Acitoplazmatikus Ca2+koncentráció mérése fluoreszcens indikátor festékekkel vizsgálható /Fluo-3vagyIndo-1/

17. INTRACELLULÁRIS CITOKINTERMELÉS KIMUTATÁSA IMMUNFLUORIMETRIÁVAL jelölt citokin-specifikusellenanyagok • asejtmembránt detergenssel átjárhatóvá lehet tenni • de előtte a sejteket fixálni kell, hogy ne essenek szét a detergenstől (pl. aldehides fixáció) • előzőleg a sejtek valamilyen, a sejttípusra jellemző antigént felismerő ellenanyaggal is megjelölhetők („sejttípus marker”, pl. CD4) cytokines

18. GÉNAKTIVÁCIÓ VIZSGÁLATA A sejtaktiváció az aktiválódó génekről átíródó mRNS segítségével is kimutatható Pl. citokin gének aktivációja KVANTITATÍV (REAL-TIME) PCR (qPCR/qRT-PCR) • sejtek RNS izolálás • RNS reverz transzkripció (RT-PCR)  cDNS • cDNS polimeráz láncreakció (PCR) mennyiségi meghatározás (a génaktiváció fehérje szinten történő vizsgálata WB) minél több mRNS-t tartalmazott a minta, annál hamarabb (kevesebb ciklus alatt) éri el az amplifikáció a küszöböt

19. ELISPOTEnzyme Linked Immuno-Spot • elve hasonló az ELISA-hoz • Ig-okat, citokineket, kemokineket, granzimet és más oldott effektor molekulákat termelő sejtek számának meghatározása • érzékeny módszer:1 aktivált sejt kimutatása 300 000 közül. (Nemcsak poliklonális, de antigén specifikus aktivációt követően is kimutatja az aktivált sejteket.)

20. ELISPOTEnzyme Linked Immuno-Spot - Antigén specifikus „capture” ellenanyagok kitapasztása - Blokkolás Citokintermelő sejt helyét jelölő folt - Sejtek hozzáadása (aktiváció, inkubáció) - Mosás - Biotinnal konjugált antigén specifikus másodlagos ellenanyag hozzáadása - Avidin-enzimkonjugátum - Oldhatatlan kromogénszubsztrát hozzáadása (AEC 3-amino-9-ethylcarbazol) Az ELISPOT lemez egy lyukának felülnézete a képződött foltokkal

21. ELISPOTEnzyme Linked Immuno-Spot Leolvasás mikroszkóppal (lassú, manuális munka) vagy „ELISPOT platereader” segítségével (gyors, standardizálható - spotok számának és méretének meghatározása)

22. ÉLETKÉPESSÉG VIZSGÁLAT MTT (Dimethyl thiazolyldiphenyltetrazoliumsó) Életképesség kolorimetriás mérése (apoptótikus sejtek). NADPH-függő celluláris oxireduktáz enzimek az MTT festéket oldhatatlan lila színű formazánná redukálják. PI (propidium-jodid) Egy fluoreszcens molekula, amely képes a nukleinsavba beépülni. Áramlási citometriával vizsgálható az életképesség. Élő sejtekbe nem képes behatolni. 7-AAD (7-aminoactinomycin D) Egy fluoreszcens molekula, amely duplaszálú DNS-be interkalálódik. Élő sejtek membránján nem képes átjutni, vagyis használható életképesség mérésre áramlási citometriával.

23. SEJTOSZTÓDÁS VIZSGÁLATOK 3H-jelölttimidin beépülés- a növekvő DNS tartalmat méri (β-bomlás mérése). Nem detektálja, hogy hány sejt hányszor osztódott. Bromodeoxyuridin (BrdU) - timidin-analóg, adható kísérleti állatokba vagy sejtkultúrákhoz. Az osztódó sejtek BrdU specifikus ellenanyagok felhasználásával kimutathatók (mikroszkópia, FACS). CFSE (Karboxifluoreszceindiacetátszukcinimidil észter) Fluoreszcens festék, amely könnyen bejut a sejtekbe és intracelluláris amin struktúrákhoz kötődik. Tanulmányozható a sejtosztódás, migráció, elhelyezkedés.

24. CFSESEJTOSZTÓDÁS NYOMON KÖVETÉSE • „Cell tracer” festékek bekerülnek a sejtekbe és csapdába esnek • Az apoláros CFSE kovalensen kötődik az intracelluláris fehérjékhez • In vitro és in vivo nyomon követhető a limfociták osztódásaFokozatosan a felére csökken a fluoreszcencia intenzitás az utódsejtekben CFSE-vel jelölt nem osztódó, nem aktivált sejtek fluoreszcens intenzitása