Identificação de microrganismos por testes bioquímicos

1. Graduação em Biotecnologia Disciplina de Biotecnologia Microbiana I Identificação de microrganismos por testes bioquímicos Prof. Fabricio Rochedo Conceição fabricio.rochedo@ufpel.edu.br fabriciorc@pop.com.br 4 de novembro de 2010

2. IMPORTÂNCIA • Identificação de microrganismos; • Tratamento; • Epidemiologia – fontes de infecção - rastreabilidade • Desenvolvimento de produtos biotecnológicos; • Capacidade de metabolização de substratos particulares; • Presença de enzimas específicas; • Indicadores para a identificação de uma bactéria.

3. UM TESTE BIOQUÍMICO PODE DISTINGUIR GÊNEROS E ESPÉCIES

4. Provas rápidas – seg. a min.

5. Testes de Metabolismo • Catalase • É uma enzima que decompõe o peróxido de hidrogênio (3%) em oxigênio e água; • Indispensável na identificação de cocos Gram positivos; • Estafilococos são catalase positivos; • Estreptococos são catalase negativos; • Exceto os estreptococos, a maioria das bactérias aeróbias e anaeróbias decompõe o peróxido de hidrogênio

6. Prova da Catalase • Controle positivo: Staphylococcus aureus • Controle negativo: Streptococcus spp. • O teste da catalase não tem qualquer aplicação na distinção do grupo Enterobacter pois todos são catalase (+)s.

7. Testes de Metabolismo • Coagulase • Presença desta enzima indica patogenicidade • Na presença de plasma, os produtores de coagulase, como o Staphylococcus aureus, vão desencadear os mecanismos da coagulação • Proteína de composição química desconhecida, com atividade semelhante a protrombina, capaz de transformar o fibrinogênio em fibrina (coágulo) • Diferenciar espécies de Staphylococcus (S. aureus e S. epidermidis)

8. Coagulase - +

9. Testes de Metabolismo • Oxidase • Tetrametil-p-fenilenodiamina (1% segundo Kovacs) • Citocromo oxidase do tipo AA3 • Diferenciar os gêneros Neisseria e Pseudomonas (oxidase positiva) de outros cocos Gram - ; • Distinguir a família Enterobacteriaceae (oxidase negativa) de outros bacilos Gram negativos (oxidase positiva);

10. Prova da Oxidase • Interpretação do Teste • Azul (Púrpura): reação + • Rosa: reação –

11. Provas lentas – 24 h ou mais

12. Testes de Metabolismo Enterobacteriaceae (Gram –) A- Escherichia, Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella fermentam lactose produzindo ácido e gás B- Shigella e Salmonella não utilizam lactose em seu metabolismo. Degradam a peptona formando amônia. Ágar MacConkey - contém bile que inibe o crescimento da maioria das bactérias Gram +, cristal violeta (inibe algumas bactérias Gram +) e vermelho neutro (indicador de pH), lactose e peptona. A B A

13. Testes de Metabolismo Diferenciação de Salmonella e Shigella Ágar XLD – Xilose, lisina e deoxicolato (ácido biliar). Meio seletivo usado para isolamento de Salmonella e Shigella a partir de amostras clínicas e alimentos. Contém phenol red como indicador de pH (ácido – amarelo; alcalino – rosa a vermelho). Salmonella metaboliza o tiosulfato produzindo H2S que reage com o ferro produzindo um composto escuro (centro da colônia negro).

14. PROVAS IMViC • Indol , Vermelho de Metila, Voges-Proskauer, Citrato • Esta série de quatro provas permite identificar um organismo do grupo coliforme.

15. IMViC - Enterobactérias • Teste de Indol (reativo de Kovacs) • Detecta a ação da enzima triptofanase, determinando a capacidade do microrganismo produzir Indol através da degradação do aminoácido L-triptofano. Após a incubação, adiciona-se o reativo de Kovacs (p-dimetil aminobenzaldeído). O indol se complexa ao reativo de Kovacs produzindo um anel rosa. Reação positiva Reação Negativa

16. IMViC - Enterobactérias • Teste de MR – Vermelho de metila • - O Vermelho de Metila é o indicador de pH; • - O teste é utilizado na verificação da produção de grandes quantidades de ácidos, como o ácido pirúvico no metabolismo da glicose; • - As enterobactérias usam o ácido pirúvico para produzir outros ácidos como ác.lático, ác.acético e ác.fórmico. pH >6,2 – Amarelo (negativo) pH< 4,4 – Vermelho (positivo) Reação positiva Reação negativa

17. IMViC - Enterobactérias • Teste de Voges-Proskauer(produção de acetoína) • Verifica a capacidade do microrganismo em produzir ácidos como o Acetilmetilcarbinol (acetoína) como um precursor da síntese de 2,3 butanediol. Adiciona-se NaOH que reage com a acetoína produzindo um composto vermelho. Reação negativa Reação positiva

18. IMViC - Enterobactérias • Teste de Citrato de Simmons • Diferencia os microrganismos pela capacidade de usarem o Citrato como única fonte de carbono. Azul de bromotimol como indicador de pH • Para que a bactéria possa utilizar o citrato é necessário que ela tenha a Citrato permease, que vai permitir a entrada desse composto no interior da célula; • Uma vez incorporado, o citrato será degradado pela enzima Citrase, produzindo compostos alcalinos.

19. Enterobactérias • Alguns testes bioquímicos para Enterobactérias

20. Bioquimismo - Salmonellaspp. • Plaqueamento seletivo diferencial: Proteose peptona; Extrato de levedura; Lactose; Sacarose; Salicina; Sais biliares; Cloreto de sódio; Tiossulfato de sódio; Citrato ferrico amoniacal; Fucsina ácida; HE (Hectoen enteric): 24h Colônia verde com centro negro Seletivos H2S Obs: Não vai para a autoclave!

21. Bioquimismo - Salmonellaspp. • Teste da Uréia: Uréia alcalina:

22. Bioquimismo - Salmonellaspp. • Teste TSI: • • Lactose (1%) ; • • Sacarose (1%); • • Glicose (01%); • • Vermelho de fenol; • • Tiossulfato de sódio; • • Sulfato ferroso; • Cloreto de sódio; • Extrato de carne; • Extrato de levedura; • Peptona TSI (Triple sugar iron): Carboidratos Indicador de pH 24h ou Indicador de H2S Nutrientes

23. Chave dicotômica