Analisi di laboratorio per le malattie autoimmuni sistemiche

1. Analisi di laboratorio per le malattie autoimmuni sistemiche paolo.gravina@ptvonline.it

2. AUTOIMMUNITA’ Disordine del sistema immunitario che non riconosce più le proprie strutture cellulari e tissutali e produce anticorpi diretti contro di esse. L’attivazione persistente delle vie effettrici del sistema immunitario innesca una reazione autoaggressiva che può essere di tipo umorale e/o cellulare in grado di alterare l’integrità e la funzione delle cellule e degli organi bersaglio.

3. MALATTIA AUTOIMMUNE Una malattia autoimmune deve soddisfare i seguenti criteri: -evidenza di una reazione immunitaria verso autoantigeni; -riproducibilità nell'animale da esperimento mediante inoculazione dell'antigene specifico (le lesioni sono analoghe a quelle presenti nella patologia umana); - trasferibilità nell'animale da esperimento mediante iniezione di siero contenente autoanticorpi o di cellule autoreattive.

4. CARATTERI COMUNI A TUTTE LE MALATTIE AUTOIMMUNI • familiarità • maggior frequenza nel sesso femminile • insorgenza apparentemente spontanea • presenza di ipergammaglobulinemia • decorso cronico, caratterizzato da esacerbazioni e remissioni E' anche possibile che manifestazioni cliniche di una forma si associno a manifestazioni di un'altra malattia autoimmune (sindromi da sovrapposizione).

5. Malattie autoimmuni • Malfunzionamento del sistema immunitario • Stato infiammatorio cronico del tessuto colpito • Le malattie autoimmuni sono divise in: • Connettiviti, non organo specifiche • Malattie organo specifiche • Malattie di tipo misto • Incidenza in crescita • Miglioramento capacità diagnostiche • Aumentata sensibilità al problema

6. MALATTIE AUTOIMMUNI Organo-specifiche: Sistemiche (MAS): • Lupus Eritematoso Sistemico (LES) • Scleroderma • Dermatomiosite, Polimiosite • Malattia Mista del Tessuto Connettivo (MCTD) • Sindrome di Sjögren • Granulomatosi di Wegener • Sindrome Antifosfolipidi (APS) • Tiroidite autoimmune • Diabete mellito • Epatite autoimmune

7. PRINCIPALI AUTOANTIGENI • A) ANTIGENI PROPRI DELLA MEMBRANA CELLULARE- Recettori di superficie - Antigeni variAI organo-specifica o sistemica • B) ANTIGENI INTRACITOPLASMATICI LIBERATI INCIRCOLO IN SEGUITO A CITOLISI- Nucleari, microsomici, mitocondriali, etc. AI prevalentemente sistemica • C) ANTIGENI INTRACITOPLASMATICI ESPRESSI INSUPERFICIE(Fenomeno comune a tutte le cellule endocrine)- C. Tiroidee, Insulari pancreatiche, surrenaliAI prevalentemente organo-specifica

8. AUTO-ANTICORPI • NON DIVERSI DAGLI ANTICORPI "NATURALI"O INDOTTI DA ANTIGENI ESOGENI, SE NONPER LA REATTIVITA' VERSO AUTOANTIGENI

9. DIAGNOSTICA DI LABORATORIO DELLE MAS • INDICI IMMUNOLOGICI • INDICI DI FLOGOSI • INDICI DI LESIONE CITO-TISSUTALE

10. Indici di flogosi VES PCR Sideremia ed Emoglobina : ridotte proporzionalmente alla estensione della flogosi per iperattività del sistema reticoloendoteliale e per alterazione del metabolismo del ferro.

11. INDICI IMMUNOLOGICI • AUTOANTICORPI CIRCOLANTI • ATTIVAZIONE DEL SISTEMA IMMUNITARIO • PREDISPOSIZIONE GENETICA

12. DIAGNOSTICA DI LABORATORIO DELLE MAS: AUTOANTICORPI CIRCOLANTI • NON INDICA L’ANDAMENTO DELLA MALATTIA • RICHIEDE ESPERIENZA (IN PARTICOLARE PER L’INTERPRETAZIONE DEI QUADRI DI FLUORESCENZA AL MICROSCOPIO ) • PREZIOSA PER LA DIAGNOSI CLINICA • DA CORRELARE SEMPRE AL QUADRO CLINICO

13. AUTOANTICORPICIRCOLANTI • ANA • ANTI - ds - DNA • ANTI - ENA • ACLA • LAC • ANTI - ss - DNA • ANTI - ISTONI • ANCA • FR CLASSICO • CRIOGLOBULINEMIA MISTA IgM - IgG • ANTI - EMAZIE • ANTI – PIASTRINE • ( ANTI - CITRULLINA ) ( ANTI - ALFA FODRINA ) ( ANTI - NUCLEOSOMI ) ( ALTRI )

14. CLASSIFICAZIONE DIDATTICA ANA • Antigeni nucleari estraibili :Sm, U1RNP, Ro(SSA), La (SSB), Jo1 (istidil tRNA sintasi), SCL70 (topoisomerasi) • Antigeni nucleari non estraibili:DNAss, DNAds o DNAn, istoni, centromero • Antigeni citoplasmatici:Jo-1, mitocondri, ribosomi

15. AUTOANTICORPI CIRCOLANTIINDAGINI DI 1° LIVELLO • ANA

17. Connettiviti • Tra i vari autoanticorpi si sono considerati gli ANA - anticorpi antinucleo:la loro presenza è una caratteristica peculiare delle malattie autoimmuni non organo specifiche • Hep-2 sono i substrati più sensibili pertanto più indicati nella ricerca degli ANA

18. INDAGINE DI 1° LIVELLO ANA Gli anticorpi antinucleo (ANA) sono anticorpi diretti contro macromolecole nucleari naturali native e/o denaturate comunemente presenti nel siero dei pazienti con malattie autoimmuni

19. ANAFREQUENZA DI ASSOCIAZIONE CON LE MALATTIE AUTIMMUNI SISTEMICHE • LES > 90 % • CM 100 % • SS 80 % • SSJ 60 % • P - DM 30 % • AR 30 %

20. ANA • …PRESENTI ANCHE IN PERSONE SANE • A TITOLO BASSO IN CIRCA IL 18 % DELLE PERSONE SANE DI ETA’ > 65 AA • IN CIRCA IL 4 % DELLA POPOLAZIONE SANA GIOVANE , A TITOLI MEDIO - BASSI

21. ANA • NON TEST DI SCREENING • DA RICHIEDERE SOLO SU INDICAZIONE CLINICA • ( SOSPETTO DI MAS E / O DI ALTRE MALATTIE AUTOIMMUNITARIE COME L’EPATITE AUTOIMMUNE, L’ARTRITE CRONICA GIOVANILE, ECC. )

24. ANTI - ENA - Ab • ANTI - SSA ( 52 KD E 60 KD ) ( RIBONUCLEOPROTEINE ) • ANTI - SSB ( RIBONUCLEOPROTEINE ) • ANTI - SM ( SMALL NUCLEAR RIBONUCLEOPROTEINS ) • ANTI - U1RNP ( SMALL NUCLEAR RIBONUCLEOPROTEINS ) • ANTI - SCL70 ( TOPOISOMERASI I ) • ANTI - JO1 ( ISTIDIL - tRNA - SINTETASI , IN REALTA’ A LOCALIZZAZIONE NON ENDONUCLEARE , MA CITOPLASMATICA)

27. METODI ANALITICI • Immunofluorescenza indiretta (IFI) • Immunoprecipitazione, Immunodiffusione • Controimmunoelettroforesi • Emagglutinazione • RIA / IRMA • Western Blot • Dot Blot, ImmunoBlot • ELISA

29. L’IMMUNOFLUORESCENZA (IFI) L’ immunofluorescenza indiretta (IFI)è il metodo di riferimento per il dosaggio degli anticorpi anti-nucleo (ANA): • Per la sua alta % di sensibilità e specificità • Perche’permette di identificare sia il grado di positività che il tipo di pattern fluoroscopico

30. METODO D’IFI Ag-substrato Immunocomplesso Ab nel siero Antiglobulina umana marcata NB. Osservazione a microscopio a fluorescenza a x400

32. Immunofluorescenza Indiretta • Si presta alla ricerca di auto-anticorpi per individuare la presenza di malattie autoimmuni. • Vantaggi:  • Sensibilità e specificità di reazione. • Semplicità e rapidità d’esecuzione. • Facile riproducibilità. • Permette di ottimizzare l’iter diagnostico. • Costo contenuto. • Indaga sulla presenza di auto-anticorpi e evidenzia pattern non ancora descritti. • Limiti:  • Tecnica soggettiva. • Solubilità di alcuni antigeni nucleari. • Non consente l’identificazione delle specificità anticorpali. • Necessita di un sistema ottico efficiente.

33. Interpretazione dei risultati • In ogni vetrino è presente: • un controllo positivo • un controllo negativo • Sono riportate due informazioni: • l’intensità della fluorescenza • la descrizione del pattern. • La classificazione delle immagini è fatta in base alla fluorescenza osservata (CDC di Atlanta) • ++++: fluorescenza verde brillante massima positività • +++: fluorescenza verde mela alta positività • ++: fluorescenza positiva chiaramente distinguibile • +: fluorescenza specifica più bassa • 0: negativo

38. Hep-2: pattern omogeneo Fluorescenza che interessa in maniera diffusa ed omogenea tutto il nucleo

39. Hep-2: pattern periferico Fluorescenza che interessa prevalentemente la periferia del nucleo

40. Hep-2: punteggiato fine Piccoli punti fluorescenti uniformi sparsi nel nucleo

41. Hep-2: Nucleolare Fluorescenza omogenea dei nucleoli, associata ad una colorazione e velata del resto del nucleo

43. Punteggiato a grandi granuli > 1:1280 (SmRNP)

44. Punteggiato a piccoli granuli > 1:1280 (SSA+SSB)

45. Centromerico 1:1280

46. Ribosomi

47. Granulare citoplasmatico 1:1280 (AMA)

48. Anticorpi Antinucleo (ANA) IFI su cellule Hep-2Quadri fluoroscopici Nucleari Citoplasmatici omogeneo (DNA, Istoni) punteggiato (Jo1) granulare (RNP, Sm, SSA, SSB) mitocondriale (PiruvatoDH) nucleolare (Scl-70) ribosomiale (RNP) centromerico ( CENP A.B.C) citoscheletro(actina,vimentina) Mitotici fibre del fuso mitotico (tubulina) poli del fuso mitotico (NuMa) centrioli (enolasi)