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Linea 5. Valutazione degli effetti tossicologici dell’aria prelevata in prossimità degli impianti di incenerimento. Obiettivi intermedi.

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Presentation Transcript

  1. Linea 5 Valutazione degli effetti tossicologici dell’aria prelevata in prossimità degli impianti di incenerimento Presentazione Progetto Inceneritori Bologna 13 aprile 2007

  2. Obiettivi intermedi • Analizzare il profilo tossicologico di campioni d’aria prelevati in aree circostanti l’inceneritore a confronto con campioni d’aria non interessati dall’impianto • Individuare i meccanismi d’azione • Identificare marcatori specifici dell’esposizione Bologna 13 aprile 2007

  3. Obiettivo finale • Predizione del rischio da esposizione a impianti attualmente in funzione Bologna 13 aprile 2007

  4. Bologna 13 aprile 2007

  5. Esposizione Attivazione AM AccumuloParticelle Infiammazione Acuta Infiammazione Cronica Fibrosi Meccanismi Genetici Meccanismi Epigenetici CANCRO Proliferazione Cellule Epiteliali Metaplasia Bologna 13 aprile 2007

  6. Risom et al. Mutat. Res. 592: 119, 2005 Bologna 13 aprile 2007

  7. Le azioni: 1 Bologna 13 aprile 2007

  8. Bologna 13 aprile 2007

  9. Le azioni: 2 Bologna 13 aprile 2007

  10. Il test di Ames Bologna 13 aprile 2007

  11. Test di genotossicità • COMET • Diventato popolare negli anni ’90 • Probabilmente uno dei test più usati per valutare la genotossicità • 3117 lavori recensiti in PubMed • Micronucleo • Considerato uno dei test più affidabili per valutare la genotossicità • Rete internazionale di convalidazione per esposizioni ambientali e occupazionali Bologna 13 aprile 2007

  12. Le azioni: 3 Bologna 13 aprile 2007

  13. Bologna 13 aprile 2007

  14. Il modello BALB/c 3T3 • Uno modello in grado di verificare le capacità trasformanti di composti singoli e miscele complesse e di predire la potenza cancerogena • Comprende differenti test che consentono di descrivere il ruolo e il peso della miscela in esame nel processo di cancerogenesi • Test di citotossicità • Test di trasformazione in cellule BALB/c 3T3 • Test di trasformazione in 2 fasi: iniziazione/promozione • Test delle comunicazioni intercellulari GJIC • Valutazione dell’impatto di promoventi sulla interazione cellula-cellula • Test di chemiotassi/chemioinvasione • Valutazione delle tappe tardive della cancerogenesi multifasica • Test di apoptosi Bologna 13 aprile 2007 toxicity assessment

  15. Il modello BALB/c 3T3 • Il modello: • Descrive la tossicità della miscela • Analizza la potenzialità cancerogena • Individua relazioni dose-risposta • Adatto allo studio di miscele complesse ambientali Bologna 13 aprile 2007 toxicity assessment

  16. Il modello BALB/c 3T3 • Il test di trasformazione cellulare misura un endpoint facilmente individuabile rappresentato dal focus trasformato • Il numero dei foci maligni è direttamente correlato con la dose Bologna 13 aprile 2007 toxicity assessment

  17. ARPA – Eccellenza Cancerogenesi Ambientale formazione di foci ENDPOINT FINALE FREQUENZA DI TRASFORMAZIONE (TF) numero foci/ efficienza clonale Bologna 13 aprile 2007

  18. Disegno sperimentale in vitro: modello 3T3 • Il test di trasformazione BALB/c 3T3 • Ripercorre le tappe del processo multifasico tumorale • E’ utilizzato da molti anni come test di screening per agenti cancerogeni • E’ ritenuto un ottimo test per discriminare tra agenti genotossici e non genotossici • Ha buone capacità predittive, alta sensibilità e specificità per la valutazione di composti citotossici e non citotossici Bologna 13 aprile 2007

  19. PM10 - PM2.5ultrafini TEST CITOTOSSICITA’ TEST TRASFORMAZIONE 1 sola dose Effetti acuti miscela Effetti cronici miscela Profilo Tossicologico della miscela complessa 3 dosi 3 dosi Relazioni dose-risposta Predizione del rischio cancerogeno Bologna 13 aprile 2007

  20. Le azioni: 4 Bologna 13 aprile 2007

  21. Genomica funzionale • La tecnologia microarray si basa sull’abilità di ogni acido nucleico a singolo filamento di accoppiarsi alla sequenza complementare Bologna 13 aprile 2007

  22. Bologna 13 aprile 2007

  23. esposto controllo m-RNA m-RNA ibridazione lavaggi scanner Bologna 13 aprile 2007

  24. Bologna 13 aprile 2007

  25. Bioinformatica e Data Mining • Feature Extractor • Primo screening dei dati provenienti dallo scanner. Il software ha il compito di segnalare quegli spot troppo intensi, non uniformi • Normalizzazione • Rende confrontabili i campioni etichettati con Cy3 e Cy5 ed ibridati congiuntamente su un singolo microarray. • Elimina errori sistematici dovuti a: • diversa quantità di mRNA associata ad ogni marcatore • diversa efficienza di incorporazione dei due marcatori • diversa intensità di radiazione emessa dai due marcatori differentemente misurata dal tubo fotomoltiplicatore • differenti intensità misurate in diverse parti del microarray a causa del posizionamento non perfettamente orizzontale del microarray rispetto al laser dello scanner • differenze tra gruppi di spot creati da differenti penne • Controllo qualità della slide • Analisi statistica dei dati • Maanova di R • LIMMA • Interpretazione biologica: • GoMINER High-Throughput • Integra i risultati di molteplici microarray in una singola analisi • Organizza la lista di geni modulati nel contesto di Gene Ontology un database che contiene una classificazione dei geni in categorie gerarchiche basate su processo biologico, funzione molecolare e compartimento cellulare Bologna 13 aprile 2007

  26. Tossicogenomica: la validità dell’approccio • L’espressione genica è influenzata direttamente o indirettamente dall’esposizione ambientale • L’espressione di alcuni geni è essenziale per l’insorgenza della malattia e della sua progressione • Le variazioni nella espressione dei geni mostrano una migliore sensibilità e specificità • I profili genici relativi a una specifica esposizione) possono essere usati per: • Biomarcatori di esposizione • Biomarcatori di rischio • Biomarcatori di stadio preclinico VARIAZIONE GENE FINGERPRINT PREDIZIONE DEL RISCHIO Bologna 13 aprile 2007

  27. Le azioni: 5 Bologna 13 aprile 2007

  28. Cancer potency-slope estimates • Risk assessment • Procedura per stimare la probabilità che una esposizione possa costituire un pericolo per la salute • Slope factor • Incremento del rischio di tumore misurato sull’aspettativa di vita in risposta a una esposizione Bologna 13 aprile 2007 Quale risposta?

  29. Quali modelli? In contrast to the 1986 guidelines there is no a priori focuson animal cancer bioassay EPA’s revised cancer risk guidelines, 1998 • Analisi integrata di tutta l’evidenza scientifica • Proprietà fisico-chimiche dei composti • Correlazioni struttura-attività • Informazioni farmacocinetiche • Studi meccanicistici Bologna 13 aprile 2007

  30. Focus sui modelli in vitro • Limiti degli studi a lungo termine nell’animale • Costi elevati • Specificità di specie e di ceppo • Peculiarità nelle vie di somministrazione • Difficoltà nell’estrapolazione all’uomo • Pochissimi dati su miscele complesse • Interesse internazionale a trovare test alternativi • REACH Bologna 13 aprile 2007

  31. Dati di letteratura Bologna 13 aprile 2007

  32. Dati di letteratura Bologna 13 aprile 2007

  33. Dati di letteratura Bologna 13 aprile 2007

  34. La nostra esperienza Bologna 13 aprile 2007

  35. Bologna 13 aprile 2007

  36. D B C E A Bologna 13 aprile 2007

  37. Postazione NO2 µg/m3 HCl µg/m3 A 23 <4 B 16 <4 C 17 <4 D 12 5 E 21 7 Campagna Estiva Bologna 13 aprile 2007

  38. Postazione NO2 µg/m3 HCl µg/m3 A 23 <4 B 51 <4 C 24 <4 D 22 <4 E 26 <4 Campagna Autunnale Bologna 13 aprile 2007

  39. Campagna Invernale Bologna 13 aprile 2007

  40. Frequenza di trasformazione nei diversi siti Bologna 13 aprile 2007

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