Bead Assay

1. Bead Assay Inmunoensayo con esferas paramagnéticas

2. AFTOSA - FMD (foot and mouth disease) • Es la enfermedad infecciosa mas importante en animales de hacienda debido a su fuerte impacto económico • Es altamente contagiosa (contacto directo y aerosoles) • No presenta un mortalidad muy alta, pero produce perdidas en la produccion pecuaria por un considerable periodo de tiempo

3. FMD virus (FMDV) • Agente etiológico de la FMD • Presenta una distribución mundial a excepción de América del Norte, Australia y Nueva Zelanda • Pertenece a la familia Picornaviridae y al genero Aphthovirus • Hay 7 serotipos (A, O, C, Asia 1 y South Africa Territories 1, 2 y 3) • Genoma RNAsc + de 8500 bases aproximadamente, rodeado por 60 copias de cada una de las cuatro proteínas estructurales (VP1, 2, 3 y 4) formando una cápside icosahedrica • Dentro del virion hay una pequeña cantidad de VP0 (precursor de VP2 y 4) y una copia de VPg (genome-linked protein, 3B) que se une covalentemente al extremo 5`del RNA • Posee un unico marco abierto de lectura (ORF)

4. Organización genómica del FMDV • El RNA es traducido como un único ORF en una gran poliproteína • Posteriormente sufre modificaciones postraduccionales, cortes proteolíticos generándose formas intermediarias y maduras de proteínas estructurales y no estructurales (NS) • Basándose en los productos de estos primeros cortes proteolíticos se divide al genoma en 4 regiones • L posee los dos AUG de iniciacion • P1 las cuatro proteinas estructurales VP4, VP2, VP3 y VP1 • P2 tres NS (2A, 2B y 2C) • P3 cuatro NS (3A, VPg, 3Cpro y 3Dpol )

5. Organización genómica del FMDV

6. Ciclo de infección del FMDV • Interacción temprana: Adsorción, penetración y denudamiento • Adsorción: FMDV une rápidamente a células en cultivo utilizando un numero limitado de sitios receptores (VP1-Receptor de Fibronectina, VP1-HS) • Traducción viral • Posteriormente al denudamiento, la proteína asociada al genoma viral (VPg) es clivada por enzimas celulares • Los productos del clivado del factor de iniciación de síntesis proteica (eIF4G) por la proteasa viral Lpro inhiben la traducción Cap dependiente del mRNA en células infectadas y permiten el inicio de la traducción del RNA viral • La poliproteína viral es cortada por una proteasa viral (3Cpro) relacionada con la familia de las serina proteasas, cuyos productos dan lugar a formas inmaduras y maduras de las proteínas estructurales y NS

7. Ciclo de infección del FMDV • Trascripción viral y replicación del genoma • Partiendo del RNA+ asociado a la VPg, la RNA polimerasa viral RNA dependiente 3Dpol genera un RNA- • La forma replicativa (RF) es un RNAdc (RNA-/+), es necesario separar las dos hebras de RNA para el inicio y elongación de las nuevas moléculas de RNA+ (2C actividad ATPasa y motivos de Helicasa?) • Encapsidamiento y maduración viral • El paso final en el proceso replicativo es el encapsidamiento del RNA+ y el posterior clivado del precursor VP0 en las formas maduras VP2 y VP4

8. Factores de Patogénesis • Por definición todas las proteínas virales estructurales y no estructurales serian en alguna medida factores de patogénesis • Los más determinantes: • VP1: absorción viral, interactúa con los receptores celulares • Lpro: proteasa que inhibe la traducción cap dependiente en las células infectadas y permite el inicio de la traducción del RNA viral

9. Respuesta del huésped • FMDV produce una rápida respuesta humoral tanto en animales infectados como vacunados • Esta es dirigida a epitopes de las tres proteínas estructurales presentes en la superficie de la cápside viral (VP1, VP2 y VP3) • Una buena respuesta protectiva aparece entre los 7 a 14 días post infección o vacunación • Existe el estado de portador, desconociéndose su implicancia en el mantenimiento del virus en la población

10. Control de la enfermedad • Vacunas corrientes • Virus inactivo • Para su producción se precisan altas medidas de contención (P4), aumentando su costo • La presencia de NS contaminantes es casi inevitable • Dificulta diferenciar animales infectados de vacunados • No produce una rápida respuesta protectiva (ventana infectiva) • Pool de antígenos virales

11. Control de la enfermedad • Estrategias alternativas de vacunación • Proteínas y péptidos • VP1 purificado • Péptidos derivados de VP1 • Péptidos de VP1 químicamente sintetizados • Expresión de proteínas fusionadas a VP1 • Vacunas a virus atenuado • Cápside viral vacía

12. Diagnóstico • Un componente esencial en toda estrategia de control de enfermedad es un método de diagnóstico rápido que confirme los signos clínicos iniciales (vesículas, estomatitis, etc) • Debe ser lo suficientemente sensible como para distinguir entre un animal infectado o uno convaleciente o vacunado

13. Diagnóstico • ELISA de captura antigénica • Se obtienen resultados a las 4 a 6 horas de recibida la muestra • Los resultados negativos deben ser confirmados por inoculación de cultivos celulares sensibles, demorando 4 días • RT-PCR • En desarrollo • Los resultados se obtienen aproximadamente a las 2 horas

14. Diagnóstico • Ensayos para diferenciar animales infectados de vacunados • Cowan y Graves describen un antígeno NS de FMDV altamente inmunogénico (VIAA, virus infection associated antigen), que luego se demostrará que es la RNA polimerasa viral 3Dpol • Estudios de radioinmunoprecipitación identificaron un grupo de NS que reaccionaban con los sueros de animales infectados, pero no con los de animales vacunados. Estos son: • 3AB • 2C • 3C • 2B • Actualmente se utiliza un método ELISA con los antígenos NS seleccionados (3AB, 2C, 3C y 2B)

15. Ensayo con esferas paramagnéticas • La tecnología de esferas paramagnéticas se emplea para inmunoensayos, para la purificación de ácidos nucleicos, proteínas, etc. • Al ser partículas magnéticas pueden ser rápidamente separadas de una suspensión sin requerir centrifugaciones, filtraciones, etc. • Las esferas están cubiertas por grupos activos que en situaciones adecuadas reaccionan y unen covalentemente la proteína seleccionada • Poseen una gran superficie de contacto lo que favorece al pegado de las proteínas y la sensibilidad final del ensayo

16. Ensayo con esferas paramagnéticas • El Antígeno NS seleccionado es la Poliproteína viral 3ABC • Altamente inmunogénica • Presente únicamente en animales infectados • Se obtiene por clonado en un vector de expresión luego se transforman células competentes y se induce en medio con IPTG • Se purifica y se realiza el “pegado” a las esferas paramagnéticas

17. Ensayo con esferas paramagnéticas • Método • Los sueros a ensayar se los incuba con una suspensión de esferas paramagnéticas durante una hora a RT • Se imantan las muestras, se retira el sobrenadante y se realizan varios lavados • Se incuban con un segundo anticuerpo (conjugado Cy5-Goat anti Bovine IgG) • Se vuelven a imantar, se retira el sobrenadante y se hacen los lavados con PBS • Se leen las muestras en un Fluorómetro

18. Ensayo con esferas paramagnéticas • Resultados • Se ensayaron los siguientes sueros • Suero infectado 325 • Suero normal 915 • Sueros Vacunados • Blanco: Esferas + PBS + Conjugado

19. Ensayo con esferas paramagnéticas

20. Ensayo con esferas paramagnéticas