Использование гетерологичного стандарта. [ cDNA ] n = [ cDNA ] 0 *( q c ) n

3. Использование гетерологичного стандарта. • [cDNA]n = [cDNA]0*(qc)n • [stDNA]n = [stDNA]0*(qst)n • [cDNA]n / [stDNA]n = [cDNA]0 / [stDNA]0 * • (qc/qst)n = 1 только при qc = qst • При qc/qst =0.95 (05%) и n=25 (qc/qst)n = 0.28 (отличия в 3.6 раза) • При qc/qst =0.90 (10%) и n=25 (qc/qst)n = 0.072 (отличия в 14 раз) • При qc/qst =0.85 (15%) и n=25 (qc/qst)n = 0.017 (отличия в 58 раз) • Неконкурентные условия ПЦР. • Недостаточная чувствительность методадетекции(EtBr).

5. Количество статей с использованием Real Time PCR Исследования MedLine, 18 окт., 2001 г. Methods 25, 383 - 385, 2001

6. Метод основан на измерении флюоресцентного сигнала в каждом цикле амплификации. Интенсивность сигнала пропорциональна концентрации конечного продукта ПЦР.

7. iCycleriQReal-Time PCR DetectionSystem (1998) MyiQ Single-Color Real-Time PCR Detection System • амплификатор • 96 образцов в прозрачных ПЦР-пробирок или микропланшетах • флюоресцентный детектор • компьютер

8. Галогеновая лампа широкого спектра (1) • сменные пары экстинционныхи эмиссионных фильтров, автоматически подбираются по красителю 4 пары фильтров 400 - 700 нм (2) • одновременная регистрация сигнала от 96 образцов (4) • одновременная регистрация4-х флюорофоров с разрешением 350 тыс. точек на лунку

9. 2009 LED+PhSD 6 channels CFX 96

10. Галогеноваялампаширокогоспектра (1) • сменныепарыэкстинционныхи эмиссионныхфильтров, автоматическиподбираютсяпокрасителю 4 парыфильтров 400 - 700 нм (2) • одновременнаярегистрациясигналаот 96 образцов (4) • одновременнаярегистрация4-х флюорофоров с разрешением350 тыс. точекналунку

11. Неспецифические (интеркалирующие) красители • +: Недорого • -: Неспецифичность детекции (любая дцДНК) • Специфические (метка связана с олигонуклеотидом) гибридизационые зонды • +: спецефичностьдетекции, мультиплексная детекция (несколько меток),количественная оценка,определение точечных мутаций

12. 5’ 3’ Синтез 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ Taq Taq 5’ 5’ 5’ Taq Taq 5’ l l l SYBR SYBR SYBR SYBR SYBR SYBR SYBR SYBR SYBR SYBR l Повтор цикла l SYBR Green I флюоресциирует в 200 раз ярче если связан с двойной спиралью ДНК Интеркалирующие красители

13. Образцы с различным количеством ДНК HBV

14. Мультиплексный анализ Q F 3’ 5’ Tubulin Q H 3’ 5’ GapdH HEX Q TX TXRED 3’ 5’ b-actin Cy5 Q Cy5 3’ 5’ Cyclophilin Гибридизационные зонды

15. 5’ 3’ Q R 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ R R Q 3’ Taq Taq Taq Taq Q R R R 5’ 3’ l 3’ 5’ Q Q 3’ 5’ ТехнологияTaqManTM

16. TaqMan генерирует сильный кумулятивный флюоресцентный сигнал • Если в начале реакции содержится x копий мишени, TaqMan высвобождает в первом цикле x флюоресциирующих меток. • Во втором цикле общее кол-во свободных меток в растворе 3x • В третьем цикле общее кол-во свободных меток в растворе 7x • В 25-м цикле общее кол-во свободных меток в растворе 33,554,431x • В некоторых случаях гаситель способен флюоресцировать. • Дополнительные усилия по фильтрации • Спектр флюоресценции репортера должен отличаться от спектра флюоресценции гасителя • Ограничение на выбор меток (мультиплексный анализ) • Производство лицензировано, спектр зондов от производителя недостаточно широкий

17. l Q Molecular Beacon R 3’ 5’ l R Q R Q 5’ 3’ 5’ 3’ Денатурация Beaсon Отжиг и детекция Температура детекции должна быть НИЖЕ температуры элонгации чтобы избежать гидролиза Taq ДНК-полимеразой

18. Высокая специфичность • Исследование известных мутаций • Исследование точечных мутаций • В вeacon можно использовать “черный” гаситель, который рассеивает энергию в виде тепла • Меньше ограничений на выбор флюорофора-репортера • В сравнении с TaqMan общая интенсивность флюоресценции слабее • Гидролиз зонда ДНК-полимеразой при элонгации создает увеличивающийся фон • Необходимо оптимизировать дизайн нуклеотидной структуры зондас учетом температуры плавления и гибридизации зондов На практике предсказать температуру плавления beaconсложно: концевая последовательность 10 - 15 пар. Любое изменение резко меняет свойства

19. l l l l l l l l l Q Q Q Q Q Q Q Q Q R R R R R R R R R 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ Molecular Beacon Molecular Beacon Molecular Beacon R R R Q Q Q Оптимизация температурных режимов • Протокол : • нагрев до 95° С • охлаждение 1 ° С / 20 сек. • Beacon: FAM - DABCYL

20. Tрег Tmb< Thb Задача: RFU фона низкая RFU св. высокая Началогибридизации Конец гибридизации Конец“закрытия”зонда Начало“закрытия”зонда

21. SNP Качественная Количествен. Мультплекс. Спецефич- Анализ анализ оценка оценка ность ± Интеркалирующие ?? + - - красители SYBR Гибридизационные + + + + + зонды Taqman Гибридизационные + + ++ ++ ++ зонды Beacon Возможности методов ПЦР с флюор. детекцией

23. FIG. 1. Schematic of Dig-PCR. (A) The basic two steps involved: PCR on diluted DNA samples is followed by addition of fluorescent probes that discriminate between WT and mutant alleles and subsequent fluorometry. (B) Principle of MB analysis. In the stem–loop configuration, fluorescence from a dye at the 59 end of the oligonucleotide probe is quenched by a Dabcyl group at the 39 end. On hybridization to a template, the dye is separated from the quencher, resulting in increased fluorescence. (C) Oligonucleotide design. Primers F1 and R1 are used to amplify the genomic region of interest. Primer INT is used to produce single-stranded DNA from the original PCR products during a subsequent asymmetric PCR step. MB-RED is an MB that detects any appropriate PCR product, whether it is WT or mutant at the queried codons. MB-GREEN is an MB that preferentially detects the WT PCR product.

24. FIG. 2. Discrimination between WT and mutantPCR products by MBs. Separate PCR products(n 5 10), each generated from '50 genomeequivalents of DNA of cells containing the indicatedmutations of c-Ki-Ras, were analyzed withthe MB probes described above. Representativeexamples of the PCR products used for MB analysiswere purified and sequenced directly. In thecases with Gly12Cys and Gly12Arg mutations,contaminating nonneoplastic cells within the tumorpresumably accounted for the relatively lowratios. In the cases with Gly12Ser and Gly12Asp,there were apparently two or more alleles ofmutant c-Ki-Ras for every WT allele; both thesetumors were aneuploid.

25. FIG. 4. Discriminating WT from mutant PCRproducts obtained in Dig-PCR. REDyGREENratios were determined from the fluorescence ofMB-RED and MB-GREEN as described in Materialsand Methods. The wells shown are the sameas those illustrated in Fig. 3. The sequences ofPCR products from the indicated wells were determinedas described in Materials and Methods.The wells with REDyGREEN ratios .3.0 eachcontained mutant sequences, whereas those withREDyGREEN ratios of '1.0 contained WT sequences.

26. FIG. 5. Dig-PCR of DNA from a stool sample. The 384wells used in the experiment are displayed. Those coloredblue contained 25 genome equivalents of DNA from normalcells. Each of these registered positive with MB-RED,and the REDyGREEN ratios were 1.0 6 0.1 (mean 61SD). The wells colored yellow contained no template DNA,and each was negative with MB-RED (i.e., fluorescence,3,500 SFU.). The other 288 wells contained diluted DNAfrom the stool sample, prepared by alkaline extraction (57).Those registering positive with MB-RED were coloredeither red or green, depending on their REDyGREENratios. Those registering negative with MB-RED werecolored white. PCR products from the indicated wells wereused for automated sequence analysis.

30. QX100™ Droplet Digital™ PCR QX100 Droplet Generator C1000 Cycler QX100 Droplet Reader http://www.youtube.com/watch?v=Qwma-1Ek-Y4