Mikroorganismu gēnu inženierija

1. Mikroorganismu gēnu inženierija 3. Lekcija 2013./2014. mācību gada 2. semestris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

2. E. coli Populārākais GI lietotais organisms ir zarnu nūjiņa Escherichia coli Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

3. E. coli Populārais mikroorganisms nosaukts nozīmīga austriešu pediatra un mikrobiologa Theodor Escherich (1857 - 1911) vārdā. Zinātnieks īpašu uzmanību veltījis gremo- šanas trakta normālas darbības saistībai ar tajā mītošajiem mikroorganismiem, aprakstījis un skaidrojis E. coli nozīmi orga- nismā, cīnījies pret bērnu lielo mirstību no zarnu infekcijām. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

4. E. coli Neskatoties uz to, ka E. coliirnormālās zarnu mikrofloras neatņemama sastāvdaļa, sastopamas arī patogēnas formas, kuras var radīt zarnu darbības traucējumus - gan • parastu (ūdeņainu) caureju, • gan hemorāģisku caureju (ar gļotu, asiņu un lekocītu piejaukumu). Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

5. E. coli Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

6. E. coli • Visplašāk lietotieE. coli celmi ir cēlušies no wtlīnijas K-12, kuru Stenfordas universitātē 1922. gadā izolēja no difterijas pacienta. • Edward Tatum(bioķīmiķis, baktēriju ģenētiķis; 1909 - 1975) 40-tos gados popularizē K-12 izmantošanu kā ērtu eksperimenta objektu. Metabolisma ceļu posmus (reakcijas) kontrolē noteikti gēni. (1958) Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

7. E. coli 70-tos gados pierādās, ka K-12 celma baktērijas nespēj efektīvi apmesties cilvēka zarnu traktā. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

8. E. coli Escherichia coliK-12atvasinājumupriekšrocības 1. fizioloģiski, ģenētiski un molekulāri vislabāk pazīstamais organisms. 2. Praktiski visos nacionālajos un starptautiskajos darba drošības klasifikatoros tas atzīts par bioloģiski drošu mikrobioloģiskiem un gēnu inženierijas eksperimentiem (ir arī patogēnas līnijas, bet ne K-12). 3. Izveidotas daudzas, dažādām vajadzībām noderīgas, GI vektoru sistēmas. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

9. E. coli Escherichia coliK-12atvasinājumupriekšrocības 4. Viegli modificējams ar dažādām ģenētiskām metodēm. 5. Piemērotos apstākļos dalās ik pa 30 (15) minūtēm. 6. Pētījumu un ražošanas vajadzībām izveidotas daudzveidīgas ģenētiskas un un fenotipiskas vareitātes. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

10. Patogenitāte Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

11. Patogenitāti Nosaka virulences faktori: Mikroorganisma īpašību kopums, kas nepieciešams, lai tas: - veiksmīgi kolonizētu kādu citu organismu; - izvairītos no saimniekorganisma aizsargreakcijas; - radītu saimniekorganismā patoloģiskas izmaiņas. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

12. Patogenitāti Nosaka virulences faktori: - kustību orgāni; - spēja piesaistīties noteiktām šūnām; - izdalītie un baktērijā ietvertie toksīni; - baktērijas apvalki. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

13. Patogenitāti Mūsdienās parasti raksturo ar imunoloģisko reakciju palīdzību - nosaka serotipu. Viena vai otra virsmas antigēna klātbūtne - raksturo mikroorganisma līniju (celmu), - saistīta ar mikroorganisma patogēnajām īpašībām. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

14. Virulences faktori I Kustību orgāni: viciņas (~ 15 nm Ǿ) Palīdz baktērijām iekļūt dažādos dobumos, Pārvarēt dabīgo gļotu u.c. šķidrumu plūsmas virzienu, Izkļūt cauri gļotādu gļotu slānim. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

15. Virulences faktori I Dažu antigēnu apzīmējumi cēliušies no pētījumiem ar Proteus vulgaris. H no vācu Hauch – dvesma, pūsma; O – ohne Hauch – bez dvesmas, pūsmas Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

16. Virulences faktori I H-antigēni atrodas uz mikroorganismu viciņām, kuras satur proteīnu - flagelīnu. Zināmi vairāki dažādi flagelīni, kas nosaka H antigēna tipu. Šie antigēni ir termo-labili (termoneizturīgi), labi inducē imūnsistēmas atbildes reakciju. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

17. Virulences faktori I E. coli bieži atrodas formās bez viciņām, un to veidošanos var panākt ar pusšķidra agara palīdzību. Ir arī līnijas, kuras vispār viciņas neveido, tās apzīmē kā H "-" serogrupu. (pilno serotipu raksturo gan O gan H antigēns) Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

18. Virulences faktori II Nodrošina mikroorganisma saistību ar saimniekšūnu. Baktērijām raksturīgas fimbrijas: Proteīnu veidojumi (5-7 nm Ǿ), Nekustīgi Daļēji raksturojami ar K antigēnu serotipu. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

19. Virulences faktori II K antigēnu serotipu nosaka arī citas baktēriju virsmas molekuls, ne tikai fimbriju proteīni. Šūnapvalka proteīns - intimīns ierosina saimniekšūnas citoskeleta deformāciju, tā rezultātā baktērija tiek apņemta ar šūnas kroku. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

20. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

21. Virulences faktori II K-antigēni – atrodas baktērijas šūnu apņemošā polisaharīdu kapsulā, bieži ir termolabili, un ķīmiskā ziņā dažādi – gan polisaharīdi gan proteīni. Pēdējā laikā serotipēšanā izmanto tikai O un H antigēnus. E. coli K-12līnijas nosaukums nav saistīts ar K antigēna serotipu! Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

22. Virulences faktori III O-antigēni - atrodas tieši uz šūnapvalka virsmas, tos veido šūnapvalka lipopolisaharīdi. Atšķirības nosaka ogļhidrātu atlikumu izkārtojums polimēros. Baktēriju šūnapvalku lipopolisaharīdiem nereti piemīt toksiskas īpašības, piemēram, endotoksīns - lipīds A. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

23. Virulences faktori E. colizināmi vismaz: 171 dažāds O-Antigēna tips, 56 H-Antigēna tipi, 80 K-Antigēna tipi. Nosakot O un H antigēnus teorētiski var izdalīt ap 9 000 serotipus. Praktiski aprakstīti 700-800 serotipi. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

24. Virulences faktori IV Toksīni Endotoksīni: Atrodas baktērijas šūnas sieniņā vai citoplazmā. Atbrīvojas baktērijai sadaloties. Nokļūstot asinsritē, tie var radīt šoku - – attīstās drudzis, - pazeminās asinsspiediens, - aktivējas asins recēšanas sistēma, - rodas asinsrites traucējumi, - tiek traucēta vielmaiņa (īpaši glikozes). Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

25. Virulences faktori IV Toksīni Lipīds A ir fosoforilēts N-acetil- glikoz-amīna dimērs, saistīts ar 6 -7 piesāti- nātām taukskābēm. Bieži ietilpst gramne- gatīvo baktēriju šūnap- valka lipopolisaharīdu sastāvā. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

26. Virulences faktori IV Toksīni Lipīds A Endotoksīna iedarbības veidu modulē piesaistītā O-antigēna tips. Lipopolisaharīda uzbūves shema O-specifiskā polisaha- Lipofīlā daļa rīds daļa ārpuse šūnapvalka iekšpuse Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

27. Virulences faktori IV Toksīni Lipīds A Aktivē monocītus, makrofāgus u.c. => - inducē iekaisuma hormonu izdalīšanu, - spēcīgi stimulē iekaisuma reakcijas, - ietekmē asins recēšanas kaskādi (tromboze, hemorāģija, hipotensija). Viens no tipiskākajiem endotoksīniem. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

28. Virulences faktori IV Toksīni Eksotoksīni: Toksiskas vielas, kuras baktērijas izdala vidē dzīves laikā. Visbiežāk proteīni ar audu specifisku iedarbību: - enterotoksīni, - neirotoksīni u.c., kas traucē saimniekšūnu darbību. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

29. Virulences faktori IV Toksīni Enterotoksīnus Enterotoksīnus var sastapt dažās E. coli, Salmonella, Shigella, Clostridium, Vibrio, Staphylococcus, Yersinia u.c. mikroorganismu līnijās. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

30. Virulences faktori IV Toksīni Enterotoksīni E. colinozīmīgākie: šigatoksīni STx1 un STx2 un LTI toksīns. Uzskata, ka šigatoksīnu gēnus no Shigella (dizentērijas izraisītāji) uz E. coli pārnesuši baktēriju vīrusi. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

31. Virulences faktori IV Toksīni Enterotoksīni • Iedarbojas uz tievās zarnas receptoriem, rada poras šūnas membrānā, veicina cAMP veidošanos. Rezultāta tiek: • bloķēta jonu, glikozes un aminoskābju uzņemšanu, • notiek pataloģiska ūdens un citu savienojumu izdalīšanās no organisma zarnu traktā. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

32. Virulences faktori IV Toksīni Šiga toksīna B subvienība • saistās ar zarnu epitēlija glikolipīdiem, • ar receptoru mediēto endocitozi iekļūst šūnā, • neatgriezeniski inaktivē 60S rRNS, kas bloķē jaunu proteīnu sintēzi un rada šūnas bojāeju, • arī mikrovaskulārus bojājumus un hemorāģiju. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

33. Virulences faktori IV Toksīni Šiga toksīnsa neirotoksiskums: • drudzis, • abdomināli muskuļu krampji. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

34. Virulences faktori IV Toksīni LT (labilie toksīni) • Iedarbojas uz tievās zarns receptoriem • bloķē Na+ absorbciju, • rada ūdens, Cl-, K+ un HCO3- pārmērīgu izdalīšanos. • (karbonātu zudums rada asins bufersistēmas trucējumus, kas var radīt metabolisko acidozi) Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

35. Virulences faktori IV Toksīni Toksīni + K + H O Na 2 - Cl X - HCO Fimbrijas 3 GTP- ciklāze Zarnu epitēlijs Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

36. Virulences faktori V Pielāgojumi, lai izvairītos no imūnsistēmas iedarbības: - antivielām, - fagocītiem. Gļotu apvalki. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

37. Virulences faktori VI Mikroorganismu veidotie antioksidanti palīdz izvairīties no imūnsistēmas "uzbrukuma", kas notiek ar aktīvo skābekli saturošo savienojumu (reactive oxygen species - ROS) palīdzību. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

38. Virulences faktori VI Piemēram, zeltainais stafilokoks, Staphylococcus aureus, - kurš ir ilgstošs ķermeņa mikrofloras pārstāvis ~ 20% cilvēku; - kā arī rada lielāko daļu stafiloku ierosināto infekciju, Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

39. Virulences faktori VI satur antioksidantu - stafiloksantīnu (staphyloxanthin), kurš šī mikroorganisma kolonijām piešķir dzelteno krāsu. S. aureus mutantas līnijas, kuras šo pigmentu neveido, saslimšanas ierosina reti. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

40. Virulences faktori Virulences faktori nereti var būt: - daļēji kodēti baktērijās esošās plazmīdās, - var tikt transducēti ar bakteriofāgu palīdzību. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

41. Parastā mikroflora Dažādas caurejas Meningīts Escherichia coli Urīnceļu iekaisumi Pneimonija Nieru iekaisumi Asinsvadu iekaisumi Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

42. E. coli patogēnās grupas Enterohemoraģiskie E. coli (EHEC) Tās ir šigatoksīnus veidojošās (STEC) E. coli Bieži ierosina hemoraģisku kolītu (asiņaina caureja) un hemolītisko urēmiju. ASV katru gadu reģistrē ap 2000 šādu saslimšanas gadījumu. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

43. E. coli patogēnās grupas Enterohemoraģiskie E. coli (EHEC) Tipiskākais pārstāvis: E. coli O157:H7 (BSL3) “Hamburgeru slimība” zināma no 1982. gada. Izraisītāji sastopami zālēdāju (govju) gremošanas traktā. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

44. E. coli patogēnās grupas Enterohemoraģiskie E. coli (EHEC) Nozīmīgākie avoti pārtikā : - maltā gaļa un tās produkti, žāvēti salami, - nepastarizēts piens un no tā gatavoti mīkstie sieri, - nepastarizēta ābolu, apelsīnu sula un sidrs, - lapu salāti un citi ar organisko mēslojumu piesārņoti dārzeņi. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

45. E. coli patogēnās grupas Bez O157:H7 serotipa zināmas vēl sešu citu serotipu E. coli baktērijas (O26, O103, O111, O121:H19, O128, O145), kuras sastopamas retāk, taču tās arī izraisa smagas saslimšanas (var būt ar letālu iznākumu). Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

46. E. coli patogēnās grupas Urīnceļu patogēniE.coli(UPEC) ASV 7 milj gadījumu gadā Neonatālā meningīta E. coli(NMEC) Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

47. Drošam darbam ar E. coli • Lai novērstu atvieglotu rekombinanto plazmīdu izplatīšanos baktēriju populācijā ar konjugācijas palīdzību un nonākšanu, piemēram, cilvēka zarnu traktā, GI tiek izmantotas plazmīdas, kas nesatur: - mob (mobility) gēnus un - bom (basis of mobility) rajonu ar nic saitu. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

48. Drošam darbam ar E. coli Šie elementi nepieciešami, lai plazmīdas varētu izplatīties konjugācijas ceļā: mob gēna proteīni - katalizē fosfodiester saites šķēlumu nicsaitā un - ierosina plazmīdas DNS replikāciju pēc "slīdošā apļa" principa, kā rezultātā var notikt viena DNS pavediena transports pa konjugācijas pila kanālu uz citu baktēriju. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

49. Drošam darbam ar E. coli Šādā veidā izpaltās dabīgās Col E1 grupas plazmīdas. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

50. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.