Mikroorganismu gēnu inženierija

1. Mikroorganismu gēnu inženierija 16. lekcija Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

2. Kosmīdu vektori Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

3. Kosmīdu vektori l fāga vektoros iespējams klonēt līdz 23 kbp DNS. Nereti klonējamie gēni pārsniedz šos izmērus un tādēļ l vektoros nav iespējams iegūt pilna garuma gēnus. Darbs ar l fāgu ir sarežģītāks nekā darbs ar baktēriju plazmīdām. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

4. Kosmīdu vektori 70-gadu beigās izveidoja klonēšanas vektorus, kas apvieno l fāga un plazmīdas īpašības(Collins and Hohn, 1978). Tā kā šie vektori satur lcos saitu, tos nosauca par kosmīdu vektoriem. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

5. Kosmīdu vektori Kosmīdu vektoru īpašības: • plazmīdas replikācijas ORI; • selektīvais marķieris (antibiotiku rezistences gēns); • restriktāžu saiti klonēšanai; • DNS fragments, kas satur l fāga cos saitus ligētā veidā; • kosmīdai svarīgs ir neliels izmērs (zem 8 kb), lai tajā varētu klonēt pat līdz 70 kb lielus DNS fragmentus. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

6. Kosmīdu vektori Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

7. Kosmīdu vektori Klonēšana kosmīdu vektoros. Kosmīdu vektorus pavairo un izdala kā plazmīdas. Kosmīdu vektoru DNS un klonējamā DNS tiek sašķeltas ar atbilstošajām restriktāzēm un ligētas in vitro. Ligēšanas reakciju veido tā, lai klonējamā DNS atrastos starp secīgi orientētiem kosmīdas posmiem. Ligēšanas produktus in vitro iepako fāga kapsīdā. Kapsīda A proteīns šķeļ cos saitus un iepako starp tiem esošo DNS fāga kapsīdā. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

8. Kosmīdu vektori Klonēšana kosmīdu vektoros: E. coli šūnas inficē ar fāga daļiņām, kas satur kosmīdas ar insertiem. Šūnā kosmīdu DNS atkal cirkularizējas un replicējas izmantojot plazmīdas ori. Piemērs - vektors pWE15 Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

9. Kosmīdu vektori Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

10. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

11. Mākslīgās hromosomas Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

12. Mākslīgās hromosomas Lai klonētu vēl lielākus genoma fragmentus (virs 100 kb) izveidoti vektori, kurus sauc par mākslīgajām vai artifikiālajām hromosomām (Artificial Chromosome). Izšķir: Fāga P1 vektori; Baktēriju mākslīgās hromosomas - BAC; Fāga P1 mākslīgās hromosomas - PAC; Raugu mākslīgās hromosomas - YAC;. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

13. P1 P1 vektori sākti veidot 1990. g. Ļauj ievietot līdz 115 kb garus insertus. Tiek izmantotas konstrukcijas, kurās plazmīdu flankē bakteriofāga P1 loxP saiti, lai cirkularizētu genomu. DNS cirkularizācijai nepieciešamas E.coli līnijas, kuras ekspresē cre gēnu. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

14. P1 cre - kodē bakteriofāga P1 rekombināzi. CRE recombināze katalizē specifisku DNS rekombināciju starp loxP saitiem. Šī rekombināze atdala arī replikācijas laikā kopā savienotos fāga genomu dimērus. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

15. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

16. P1 Normāli P1 ir dp DNS baktēriju vīruss ar ~ 90 kbp lielu genomu un izteikti lielu kapsīdu - 83-87 nm (l fāgam ~ 60 nm). Attīstības cikli - - gan lītiskais gan lizogēnais. Atšķirībā no l fāga, lizogēnā cikla laikā P1 DNS nav integrējusies baktērijas genomā. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

17. P1 Klonēšana P1. Vektoru pavairo baktēijās kā plazmīdu. Vektora un klonējamā DNS tiek sašķeltas ar atbilstošām restriktāzēm un ligēta in vitro. Pēc ligēšanas DNS in vitro iepako fāga kapsīdā. Izdara cre+ baktēriju transfekciju. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

18. P1 Klonēšana P1. Baktērijas audzē atbilstošā selektīvajā barotnē. Visas izaugušās kolonijas ir rekombinantas, jo īsi fragmenti (bez 80 - 115 kb inserta) kapsīdā netiek iepakoti. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

19. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

20. Baktēriju mākslīgās hromosomas Baktēriju mākslīgās hromosomas (Bacterial Artificial Chromosomes - BAC) ir klonēšanas vektori, kas izveidoti 1992. gadā no E. coli dabiskās F plazmīdas(Shizuya, et al, 1992). BAC vektori satur 4 rajonus no F plazmīdas: • parA un parB rajonus, kas nodrošina plazmīdu proporcionālu sadalījumu starp šūnām, stabilitāti un savietojamību; Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

21. Baktēriju mākslīgās hromosomas • oriS - vienvirziena DNS replikācijas oridžins; • repE - replikācijas kontroles proteīna gēns, kurš arī nosaka plazmīdas replikāciju no oriS; Papildus ievietots hloramfenikola rezistences gēns. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

22. Baktēriju mākslīgās hromosomas BAC vektoru priekšrocības: - visas klonēšanas un rekombinantu atlases operācijas iespējams veikt E. coli; - Ievietojams līdz 350 kbp liels inserts. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

23. Baktēriju mākslīgās hromosomas Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

24. Baktēriju mākslīgās hromosomas Klonēšana ietver: BAC vektora amplifikāciju E. coli plazmīdas veidā; vektora un genomiskās DNS šķelšanu ar atbilstošām restriktāzēm; ligēšanas reakciju in vitro; E. coli transformāciju ar rekombinantajām molekulām izmantojot elektroporāciju; rekombinanto klonu atlasi izmantojot nukleīnskābju hibridizāciju un plazmības DNS izdalīšanu un restrikcijas analīzi. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

25. Baktēriju mākslīgās hromosomas Pirmie BAC vektori (pBAC108L) pieļāva rekombinantu atlasi tikai ar restrikcijas analīzi, bet vēlāk parādījās vektori ar zili / balto selekciju (pBeloBAC11) un satur vairāk ērtu restrikcijas saitu klonēšanai. Komerciāli pieejamas jau gatavas dažādu organismu genoma bibliotekas. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

26. PAC Konstrukcijas no P1 bakteriofāga un BAC elementiem (Oannou, et al., 1994). Atšķirībā no P1 vektoriem PAC sistēmās netiek izmantota rekombinantās DNS pakošana vīrusu daļiņās, to ievada šūnās ar elektroporācijas palīdzību. Tipiska inserta garums 150 - 350 kb. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

27. PAC Pirmajos PAC vektoros ietverts: - jauns rekombinanto klonu pozitīvās selekcijas risinājums: MCS atrodas SacB gēnā, kurš kodē saharozes sintetāzi. Ja baktērijas audzē vidē ar saharozi, SacB gēna produkts katalizē saharozes noārdīšanu, veidojot levānu. Tam ir toksiska iedarbība uz E. coli šūnām kā rezultātā izaug tikai rekombinantās kolonijas. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

28. PAC Pirmajos PAC vektoros ietverts: - "pUC19-link" - fragments no pUC19 plazmīdas, kas tiek izmantots ērtai vektora pavairošanai lielā kopiju skaitā. Rekombinantu gatavošanas laikā šis posms tiek izšķelts. - ORI no P1 bakteriofāga. - lox saiti rekombinācijai. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

29. BAC & PAC Tālākajā BAC un PAC vektoru attīstībā dažādi risinājumi tiek pārnesti no vienas sistēmas uz otru un grūti pat izšķirt robežu starp abiem vektoru tipiem. Šķiet patreiz virsroku ņēmuši BAC tipa vektori, jo to izmēri ir nedaudz mazāki. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

30. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

31. Raugu plazmīdu vektori Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

32. Raugu plazmīdas Plazmīdas sastopamas ne tikai baktērijās (un arhe-baktērijās), bet arī dažādos eikariotiskos mikroorganismos, piemēram, raugos un aļģēs (Chlamydomonas). Tās tāpat satur replikācijai nepieciešamās nukleotīdu secības (ORI) un regulātoros gēnus, kā arī izmanto šūnas DNS replikācijas enzīmus (polimerāzes, helikāzes u.c.). Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

33. Raugu plazmīdas DaudzasSaccharomyces cerevisiae līnijas satur 2m (2 mikronu) plazmīdas - 6.3 kb lielus, cirkulārus ekstrahromosomālus elementus. Tie parasti nepiešķir šūnām nekādas selektīvas priekšrocības. Plazmīdas tiek uzturētas apmēram 50 - 100 kopiju skaitā uz haploīdas hromosomas ekvivalentu. Plazmīda ir saistīta ar histoniem un veido nukleosomu struktūru. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

34. Raugu plazmīdas Satur replikācijas ORI, kas nodrošina divvirziena replikāciju VIENREIZ šūnas cikla laikā. Plazmīdas satur : 599 bp garus apgrieztos atkārtojumus flip, replikācijas kontroles gēnus REP1, REP2 un D, FLP saitspecifisku rekombināzi, rajonu, kas atbildīgs par plazmīdu sadalījumu starp meitšūnām (STB), 2mreplikācijas ORI ([ARS] - autonomās replikācijas secība) Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

35. Raugu plazmīdas Kā 2m plazmīdu kopiju skaits var sasniegt 100, - ja eikariotu šūnās replikācija tiek uzsākta tikai vienreiz šūnas cikla laikā!? Plazmīdas replikācija ietver rekombinācijas procesu. To katalizē FLP un tas notiek starp apgrieztajiem flip atkārtojumiem. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

36. Raugu plazmīdas Replikācijas ORI atrodas netālu no viena flip saita. Uzsākot replikāciju, viena replikācijas dakša drīz vien šķērso tuvāko flip saitu. Notiek rekombinācija, kas apgriež DNS starp flip rajoniem otrādi. Tā rezultātā tagad abas replikācijas dakšas pārvietojas vienā virzienā. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

37. Raugu plazmīdas Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

38. Raugu plazmīdas Tā kā abas replikācijas dakšas pārvietojas vienā virzienā, notiek nepārtraukta replikācija veidojot garus 2m plazmīdu multimērus. Pēc replikācijas beigām, ar rekombinācijas palīdzību lielais multimērs tiek pārvērsts monomēros. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

39. Raugu plazmīdas Replikācijas terminācija notiek - atkārtoti rekombinējoties flip saitiem. Tad abas replikācijas dakšas atkal pārvietojas pretējos virzienos un saduras. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

40. Raugu plazmīdas Kopiju skaitu regulē REP1, REP2 un D proteīni, kas represē FLP rekombināzes ekspresiju. Palielinoties kopiju skaitam, FLP tiek represēta, bet, kad kopiju skaits ir mazs, FLP tiek inducēta. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

41. Raugu plazmīdu vektori Rekombinanto DNS tieša iegūšana raugu šūnās tomēr nav ērta. Parasti izmanto E. coli - raugu atspoles vektorus ar: - E. coli plazmīdu replikācijas ORI, - E. coli selektīvos marķierus, - raugu selektīvos marķierus. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

42. Raugu plazmīdu vektori - raugu hromosomu vai plazmīdu replikācijas ORI. Raugos par marķiergēniem parasti izmanto noteiktu anabolisko (biosintēzes) ceļu gēnus, kombinācijā ar raugu līnijām, kurās šie gēni ir bojāti. Piemēram URA3 (uracila sintēze), TRP1(triptofāna sintēze). Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

43. Raugu plazmīdu vektori Izšķir 4 raugu plazmīdu vektoru veidus: 1. Raugu integrācijas plazmīdas (pYI;YIp) - satur E. coli plazmīdu replikācijas ORI, - E. coli un raugu selektīvos marķierus. - Nesatur raugu replikācijas iniciācijas secības (ORI). Nonākot raugu šūnās var integrēties raugu hromosomā homologās rekombinācijas ceļā. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

44. Raugu plazmīdu vektori 1. Raugu integrācijas plazmīdas (pYI; YIp) Izceļas ar ļoti lielu stabilitāti, jo meitšūnās tiek pārmantotas kopā ar hromosomām, taču vērojami arī gadījumi, kad homologās rekombinācijas rezultātā integrētā plazmīdas sekvence tiek izšķelta un līdz ar to arī zaudēta. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

45. Raugu plazmīdu vektori ORI Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

46. Raugu plazmīdu vektori 2. Raugu replikācijas plazmīdas (pYR) - satur E. coli replikācijas ORI, - ~ 100 bp garu DNS rajonu - raugu hromosomu autonomās replikācijas secību (ARS - autonomous replication sequence), - E. coli un raugu selektīvos marķierus. Spēj autonomi replicēties raugu šūnās, taču vērojama tendence šūnu dalīšanās laikā palikt kopā ar mātes-šūnu. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

47. Raugu plazmīdu vektori 3. Raugu centromēru plazmīdas (pYC; YCp) - tādas pašas kā pYR, tikai papildus satur raugu hromosomām raksturīgu centromēru, kas nodrošina vienlīdzīgu plazmīdu sadalījumu mitozē un meijozē. Izteikti maza kopiju skaita plazmīdas (parasti 1-3 kopijas vienā šūnā). Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

48. Raugu plazmīdu vektori ORI Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

49. Raugu plazmīdu vektori 4. Raugu episomālās plazmīdas (pYE; YEp) - tādas pašas kā pYR, tikai ARS vietā satur 2m plazmīdu replikācijas ORI, kas nodrošina ievērojami lielāku plazmīdu kopiju skaitu šūnā (10 - 40). Taču plazmīdu sadalījums pa meitšūnām ir nevienmērīgs, kā rezultrātā transformēto šūnu populācijā kopumā plazmīdu kopiju skaits uz šūnu ir stipri svārstīgs. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

50. Raugu plazmīdu vektori ORI Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML