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第四章 蛋白质的共价结构

第四章 蛋白质的共价结构. 蛋白质. 1830 年， Mulder – 研究在去除糖、脂和盐等物质以后剩余的成分。 1838 年， Berzelius – 使用蛋白质这个词。希腊语中的 “Proteins” 表示最重要的意思。 1958 年， Watson 提出中心法则： DNA  RNA  蛋白质 （信息流） ； DNA 的功能在于其一级结构；蛋白质的功能在其三维结构。. 什么是蛋白质 ?. 蛋白质是氨基酸的线性多聚物（≥ 50aa ）. 胰核糖核酸酶. 蛋白质 - 一条或多条肽链. 一条多肽链 - 单体蛋白 不止一条多肽链 - 寡聚蛋白

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第四章 蛋白质的共价结构

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  1. 第四章 蛋白质的共价结构

  2. 蛋白质 • 1830年，Mulder – 研究在去除糖、脂和盐等物质以后剩余的成分。 • 1838年，Berzelius – 使用蛋白质这个词。希腊语中的“Proteins” 表示最重要的意思。 • 1958年，Watson提出中心法则：DNA  RNA  蛋白质（信息流）；DNA的功能在于其一级结构；蛋白质的功能在其三维结构。

  3. 什么是蛋白质? • 蛋白质是氨基酸的线性多聚物（≥50aa ） 胰核糖核酸酶

  4. 蛋白质-一条或多条肽链 • 一条多肽链-单体蛋白 • 不止一条多肽链-寡聚蛋白 （1）同源寡聚体- 同种肽链 • （2）异源寡聚体-两种或多种不同的肽链 血红蛋白是一种异源四聚体：2条α链，2条β链。

  5. 蛋白质可大可小 • 胰岛素- A链(21aa), B链(30aa)，大小为5.7k • 大肠杆菌谷氨酰胺合成酶- 12个亚基组成，每一个亚基含有 468aa。总大小为600k。 • α连接素（connectin)：大小为28 00k! • β连接素：大小为2100k，长达 1000nm。

  6. 蛋白质分类 Globular Membranous Fibrous 结构伸展，呈纤维状，长/宽>10，不溶于水或稀盐溶液，机械强度高，在生物体充当结构的角色，如胶原蛋白和角蛋白 球状蛋白质结构紧密，呈球状，长/宽≤3～4，溶于水，如血红蛋白和胰蛋白酶等 膜蛋白则定位于各种生物膜上，其结构有限，到目前为止，只有全α-螺旋或全β-折叠结构，一般由多个结构域组成，但至少有一个结构域是脂溶性的，如细菌视紫红质

  7. 蛋白质可能含有非蛋白质成分 • 多肽链 +可能是辅助因子（金属离子、辅酶或辅基），也可能是其他修饰。 • 例如，羧肽酶的辅助因子是Zn2+；乳酸脱氢酶的辅酶是辅酶I；血红蛋白的辅基是血红素。

  8. Proteins are: Polypeptides + possibly – cofactors, coenzymes, prosthetic groups, other modifications Polypeptides are covalently linked -amino acids Cofactors are non-amino acid components e.g. metal ions like Zn2+ in carboxypeptidase Coenzymes are organic cofactors e.g. nucleotides in lactate dehydrogenase Prosthetic groups are tightly attached cofactors e.g. heme in myoglobin

  9. 蛋白质的生物功能 蛋白质可视为生物功能试剂 • 酶 ——核糖核酸酶 • 信息转导——胰岛素与其受体 • 基因表达的调控——转录因子 • 免疫——抗体 • 运输和贮存——血红蛋白和肌红蛋白 • 结构蛋白——毛发，胶原 • 收缩蛋白——肌动蛋白和肌球蛋白 • 奇异蛋白——南极鱼的抗冻蛋白

  10. 蛋白质的结构层次 • 一级结构(1º) : 独特的氨基酸序列，由遗传物质决定。 • 二级结构(2º) :多肽链的主链骨架本身（不包括R基团）在空间上有规律的折叠和盘绕，它是由氨基酸残基非侧链基团之间的氢键决定的。 • 三级结构(3º) :是指多肽链在二级结构的基础上，进一步盘绕、卷曲和折叠，形成主要通过氨基酸侧链以次级键以及二硫键维系的完整的三维结构。 • 四级结构(4º)具有两条和两条以上多肽链的寡聚蛋白质或多聚蛋白质才会有四级结构。其内容包括亚基的种类、数目、空间排布以及亚基之间的相互作用。

  11. 蛋白质的四种结构层次

  12. Hierarchy of protein structure Primary Secondary Tertiary Quaternary Secondary - e.g -helix or -sheet Primary - sequence Tertiary - 3D shape Quaternary - subunit organization (> one polypeptide chain)

  13. 蛋白质的一级结构 • 是蛋白质的共价（肽键）结构 • 对于每一种蛋白质而言，都是独特的。 • 由编码它的基因的核苷酸序列决定。 • 是遗传信息的一种形式。 • 书写总是从N端到C端。 如胰岛素A链的一级结构是： Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn

  14. 蛋白质的共价结构（一级结构） 定义 蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。 • 主要的化学键 • 肽键，有些蛋白质还包括二硫键。

  15. 一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。

  16. 一种蛋白质的一级解构由编码它的基因的核苷酸序列决定一种蛋白质的一级解构由编码它的基因的核苷酸序列决定 DNA: GGC ATT GTG GAA CAA TGC TGT ACC mRNA: GGC AUU GUG GAA CAA UGC UGU ACC 蛋白质: Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr

  17. Primary: amino acid sequence Due to covalent bond

  18. 肽键的结构与性质 • 具有部分双键的性质（40％），其键长为0.133nm，短于一个典型的单键，长于一个典型的双键。 • 与肽键相关的6个原子共处于一个平面，此平面结构被称为酰胺平面或肽平面 • 多为反式，但是X-Pro是例外。 • N带部分正电荷，O带部分负电荷。

  19. 肽键的双键性质

  20. 肽键 • 肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。 • 在大多数情况下，以反式结构存在。

  21. 肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。 • 组成肽键的原子处于同一平面。

  22. 酰胺平面的结构

  23. 肽的定义 肽就是氨基酸之间通过α-氨基和α-羧基缩合以酰胺键或肽键相连的聚合物，它包括寡肽、多肽和蛋白质。 构成肽的每一个氨基酸单位被称为氨基酸残基。各氨基酸残基以肽键相连形成的链状结构被称为肽链。

  24. Peptides Dipeptides: two amino acids linked by peptide bond (amide linkage) Peptides are written so that the free NH2 group is on the left and the free COOH group is on the right. N-terminus: alanine C-terminus: aspartic acid Ala-Asp alanylaspartic acid

  25. 肽的分类和命名 肽的命名和分类的主要依据是氨基酸残基的数目和组成。 肽的分类可根据氨基酸残基的数目而直呼其为几肽。例如，2个氨基酸形成的肽称为二肽，三个氨基酸构成的肽称为三肽，以此类推。一般将2个～10个氨基酸残基组成的肽称为寡肽，由11个~50个氨基酸残基组成的肽称为多肽，由50个以上的氨基酸残基组成的肽通常被称为蛋白质。

  26. 除了少数环状肽链以外，其它肽链都含有不对称的两端：其中含有自由α-氨基的一端被称为氨基端或N-端，含有自由α-羧基的一端称为羧基端或C-端。除了少数环状肽链以外，其它肽链都含有不对称的两端：其中含有自由α-氨基的一端被称为氨基端或N-端，含有自由α-羧基的一端称为羧基端或C-端。

  27. 纾缓激肽(Bradykinin)

  28. 非核糖体合成肽与核糖体合成肽

  29. 寡肽的理化性质 （1）解离性质 肽也有等电点，其中小肽的pI的计算方法与氨基酸相似，但复杂的寡肽只能与多肽和蛋白质一样不能计算，只能测定（如使用等电聚焦的手段）。 （2）双缩脲反应 双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应生成紫红色络合物，此反应称为双缩脲反应。凡大于二肽的肽含有与双缩脲结构相似的肽键（至少含有两个肽键，所以二肽不行），都能发生此反应。

  30. 蛋白质的一级结构 • 蛋白质的一级结构(Primary structure)包括组成蛋白质的多肽链数目。多肽链的氨基酸顺序，以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。

  31. 蛋白质一级结构的测定 • 直接测定法 • 间接测定法。 先得到某一种蛋白质基因的核苷酸序列，然后根据通用的遗传密码表间接推导出由其决定的氨基酸序列。

  32. 测定蛋白质的一级结构的要求 • 1. 样品必需纯（>97%以上）； • 2. 知道蛋白质的分子量，其误差允许在10%左右； • 3. 知道蛋白质由几个亚基组成； • 4. 测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。 • 5. 测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。

  33. 蛋白质一级结构测定的主要步骤

  34. (1)测定蛋白质分子中多肽链的数目。 • 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。

  35. (2)多肽链的拆分。 • 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。 • 可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。

  36. (3)二硫键的断裂 • 几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。

  37. 作用：这些反应可用于巯基的保护。

  38. (4)测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比；(4)测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比；

  39. (5)分析多肽链的N-末端和C-末端。

  40. (6)多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。(6)多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。

  41. (7)测定每个肽段的氨基酸顺序。

  42. (8)确定肽段在多肽链中的次序。 利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。

  43. (9)确定原多肽链中二硫键的位置。

  44. N末端和C末端氨基酸残基的测定 • 多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。 • 在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。

  45. 1. N末端氨基酸的分析方法 （1）二硝基氟苯法（DNFB) 由于DNFB与氨基酸中-氨基形成的键对酸 水解稳定性远比肽键高，因此DNP-多肽经酸水 解后，只有N-末端氨基酸为黄色DNP-氨基酸衍 生物，其余的都是游离氨基酸，用纸层析可以 鉴别氨基酸。

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