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2. Analisi di macromolecole biologiche • Classi di macromolecole biologiche • Proteine - Peptidi • Acidi nucleici • Polisaccaridi • Lipidi • Proprietà • Alto/altissimo peso molecolare • Proprietà chimico-fisiche eterogenee • Campioni biologici estremamente complessi

3. Metodologie analitiche integrate Campione complesso (cellula, fluido biologico) Tecniche preparative e/o separative (rimozione di interferenti, separazione degli analiti) Tecniche di caratterizzazione (identificazione e quantificazione degli analiti)

4. Tecniche analitiche • Tecniche separative • HPLC, SEC, CZE, elettroforesi su gel. • Approcci multidimensionali con tecniche ortogonali o “in tandem” • Tecniche MS • Sorgenti: a bassa frammentazione ESI, MALDI • Analizzatori: adatti all’analisi di valori m/z elevati (TOF, quadrupolo (con ESI), FT ICR. • Spettrometria di massa tandem con analizzatori ibridi

5. I progetti -OMICI • Genoma • Identificare tutta la serie di ordini che il codice genetico può impartire ad una cellula, per comprendere e prevenire situazioni patologiche • Trascrittoma • Identificare e quantificare tutta la serie di ordini che il genoma impartisce effettivamente alla cellula, per comprendere ed eventualmente correggere le modalità di regolazione genica • Proteoma • Caratterizzare e quantificare il contenuto proteico di un sistema cellulare, mediante la determinazione di profili di espressione differenziati nel tempo e nello spazio, comprensivi delle informazioni sulle interazioni molecolari

6. Ruolo della MS in proteomica • Proteomica sistematica • Identificazione e sequenziamento di tutte le proteine contenute in un tessuto. (analisi di miscele di peptidi e proteine intere) • Proteomica strutturale (o differenziale) • Studio delle differenze di espressione (qualitative o quantitative) rilevabili nel proteoma al variare delle condizioni del tessuto (es. cellula sana vs. cellula malata (determinazione di mutazioni nella sequenza, modifiche post-traduzionali, modifiche conformazionali, sovra o sottoespressione) • Proteomica funzionale • Studio della funzione biologica delle proteine e delle loro interazioni con proteine e peptidi (Separazione in condizioni non denaturanti e caratterizzazione allo stato nativo)

7. Proteomica sistematica Cellule, fluidi biologici Lisi, 2D-Gel Sequenziamento e identificazione (anche per confronto con il genoma)

8. Proteomica differenziale Cellule sane, non trattate, ecc… Cellule patogene, trattate, ecc… Lisi, 2D-Gel

9. Proteomica funzionale Variazione del peso molecolare Legame covalente irreversibile Legame covalente reversibile Nessuna variazione del peso molecolare Variazioni della conformazione Nessuna interazione Interazioni non covalenti Interazioni Proteina-Peptide

10. Schema di uno spettrometro di massa Computer Segnale Sistema di introduzione Sorgente di ioni Analizzatore di massa Rivelatore Campione Ioni Ioni 10-5-10-8 torr Campione Sistema di vuoto

11. Criteri per la scelta della sorgente • Caratteristiche del campione • Stato di aggregazione: solido, liquido. • Metodo di introduzione: in flusso/discontinuo. • Dimensione del campione • Concentrazione dell’analita nel campione • Caratteristiche dell’analita • Peso molecolare • Complessità della molecola • Polarità (ionizzabilità)

12. Sorgenti ioniche a pressione atmosferica Stato del campione Sorgente a flusso Liquido Elettrospray (ESI) – nanospray APCI (atmospheric pressure chemical ionization) APPI (atmospheric pressure photoionization) LC: flussi ~ 0.1 – 1 cm3 min-1. Se l’eluente è acqua, 0.1 cm3 min-1 = 5.6 mmol min-1 = 135 cm3 min-1 (c.n.) Nano-HPLC: flussi ~ 10-4 cm3 min-1 0.1 cm3 min (c.n.)

13. Classificazione delle sorgenti ioniche • Sorgenti “dure” (elevata frammentazione) • Ionizzazione elettronica • Sorgenti “molli” (bassa frammentazione) • Fotoionizzazione (APPI) • Ionizzazione chimica (APCI) • Desorbimento (ESI, MALDI)

14. Applicabilità delle sorgenti a pressione atmosferica

15. ESI vs APCI - Sensibilità zona di applicabilità ideale Sensibilità relativa Flusso (µL/min) La ESI è sensibile alla concentrazione dell’analita, la APCI alla sua quantità assoluta. Per questo la ESI si presta ad essere accoppiata alla micro e nano HPLC per applicazioni in cui il campione sia disponibile in quantità molto ridotte.

16. Meccanismo fisico dell’elettrospray L’applicazione di un potenziale elettrico ad alto voltaggio ad una goccia di liquido ne provoca la frammentazione in goccioline fini. La causa e’ la repulsione elettrostatica tra le cariche che si generano nella goccia.

17. Sistema di nebulizzazione elettrospray Cono di Taylor Punta dell’ago

18. Sistema di desolvatazione per elettrospray Gocce di circa 1 µm Gas didesolvatazione Gas ditrasporto Liquido ditrasporto Campione Cono di Taylor Capillare riscaldato - + 2-6 kV

19. Meccanismo di deplezione degli ioni Calore o gas secco Soluzione del campione Spettrometro di massa 4000 V Pressione atmosferica Il calore e/o il gas secco causano la riduzione delle dimensioni delle gocce Vapori del solvente Livelli successivi di vuoto(2 torr – 0.1 torr – 0.01 torr) Esplosione Coulombiana Limite di Rayleigh: Limite di dimensioni della al quale si prevede la frammentazione della goccia. q2 = 8π2ε0γd3 q = carica totale della goccia ε0 = permittività elettrica del mezzo γ = tensione superficiale della goccia d = diametro della goccia

20. L’elettrospray genera spettri multicarica m/z La carica degli ioni è dovuta agli ioni metallici (es Na+) o ai protoni associati alla molecola. Gli addotti carichi sono quindi della forma: (M + H)+, (M + 2H)2+, …, (M + nH)n+

21. MALDI: vantaggi e limitazioni • Sorgente a flusso sensibile alla concentrazione, ideale per l’accoppiamento online con tecniche separative miniaturizzate e per l’analisi quantitativa • Ionizzazione soft (nessuna frammentazione) di molecole polari ad alto peso molecolare. • Produce spettri multicarica • La ionizzazione è un processo competitivo, per cui la simultanea presenza di più analiti o di sali può dare luogo ad interferenze. • La complessità degli spettri multicarica limita l’interpretazione degli spettri ottenuti da miscele complesse

22. Sorgenti ioniche a desorbimento Desorbimento/ionizzazione laser assistiti da matrice (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI) • L’analita viene codepositato su un bersaglio con una matrice, scelta per favorire la vaporizzazione dell’analita. • Caratteristiche della matrice: • Elevata assorbività alla lunghezza d’onda del laser. • Massa molare abbastanza bassa da sublimare facilmente. • Bassa reattività chimica. • Stabilità al vuoto. • Le matrici più utilizzate sono acidi aromatici

23. Il processo MALDI Il bersaglio viene colpito da un impulso laser che viene assorbito dalla matrice e provoca la formazione di un plasma contenente gli atomi dell’analita ed atomi e ioni della matrice.

24. MALDI-TOF MS Range di massa fino a 106 Analizzatore a tempo di volo.

25. Lo spettro di massa Intensità relativa m/z Spettro di massa di ioni monocarica (MALDI/TOFMS) Spettro di massa del batterio intero Escherichia coli

26. MALDI: vantaggi e limitazioni • Poco sensibile alle contaminazioni (sali, tamponi, detergenti ecc.) Solitamente non richiede complessi passaggi di purificazione del campione. • Può analizzare velocemente miscele complesse di analiti (lo spettro è facile da interpretare) • Non è una sorgente a flusso • La ionizzazione è un processo competitivo, per cui la simultanea presenza di più analiti può dare luogo ad interferenze. • L’analisi quantitativa è limitata dalla ridotta omogeneità del campione.

27. Schema di uno spettrometro di massa Computer Segnale Sistema di introduzione Sorgente di ioni Analizzatore di massa Rivelatore Campione (gassoso) Ioni Ioni 10-5-10-8 torr Campione Sistema di vuoto

28. Risoluzione La capacità di uno spettrometro di massa di differenziare le masse è generalmente espressa dalla risoluzione R definita come: R = m/Δm dove Δm è la differenza di massa tra due picchi adiacenti risolti e m è la massa nominale del primo picco (o la media delle masse dei due picchi). Due picchi sono considerati separati se l’altezza della valle tra di essi è inferiore ad una certa percentuale della loro altezza (di solito il 10%). Uno spettrometro con una risoluzione di 4 000 risolverà due picchi con valori di m/z 400,0 e 400,1 (o di 40,00 e 40,01). Gli spettrometri commerciali hanno R che variano circa tra 500 e 500 000.

29. Risoluzione Picchi risolti al 10% della valle Intensità Picchi risolti al 80% della valle Definizione alternativa La risoluzione di un picco isolato si può anche definire come larghezza δm del picco al x% dell’altezza. Spesso si prende x = 50%, e δm è la larghezza a metà altezza.

30. Classi di analizzatori di massa • A settore magnetico • A doppia focalizzazione • A quadrupolo lineare (Q) • Trappola ionica a quadrupolo (QIT) • A tempo di volo (TOF) • A risonanza ciclotronica e trasformata di Fourier (FT-ICR)

31. Analizzatore di massa a quadrupolo Potenziale nel quadrupolo

32. Traiettorie dello ione piano xz piano yz piano xz Traiettoria instabile lungo x, stabile lungo y piano yz Traiettoria stabile sia lungo x che lungo y

33. Traiettorie ioniche nella trappola a quadrupolo Moto degli ioni in direzione z Moto degli ioni in direzione r tempo Gli ioni vengono intrappolati forzandoli su traiettorie chiuse stabili all’interno della trappola. Quando la traiettoria di uno ione diventa instabile, questo esce dalla trappola e viene rivelato.

34. Analizzatore di massa a quadrupolo • Massimo valore m/z ~ 4 000 (applicabile alla MS di proteine solo in accoppiamento con la ESI) • Risoluzione ~ 3 000 • I quadrupoli sono strumenti a bassa risoluzione • Si lavora normalmente alla risoluzione di una unità di massa. • Leggero, di dimensioni contenute • Facile da accoppiare alla cromatografia • Efficiente trasmissione degli ioni • Necessaria una elevata precisione nell’allineamento delle barre degli elettrodi

35. Analizzatore a tempo di volo (TOF) Zona di accelerazione con campo elettrostatico E Ioni positivi Sorgente d V = 0 dE = V0 = 20 000 V V = V0 L

36. Reflectron TOF Sorgente Metodo per correggere la distribuzione di velocità, diminuendo Δt Reflectron TOF a stadio singolo

37. Analizzatore di massa a tempo di volo • Massimo valore m/z > 200 000 • Risoluzione fino a 105. • Il reflectron consente di: • Ridurre le dimensioni • Aumentare la risoluzione • Ideale accoppiamento con sorgenti pulsate (ma adattabile anche a sorgenti continue) • Efficiente trasmissione degli ioni

38. Principi della ICRFT MS Gli ioni in un campo elettromagnetico si muovono su traiettorie circolari (o a spirale), generando esse stesse una radiazione elettromagnetica, la cui frequenza dipende dal rapporto m/z dello ione. Tale r.e.m. può essere rivelata da un’antenna, generando un segnale che contiene le radiofrequenze di tutti gli ioni in funzione del tempo. Mediante trasformata di Fourier il segnale viene passato dal dominio del tempo al dominio delle frequenze, e di conseguenza al dominio delle masse (o meglio di m/z).

39. Analizzatore a risonanza ciclotronica Piano di ricezione Piano di emissione

40. Analisi di massa a trasformata di Fourier Segnale nel dominio del tempo Segnale trasformato nel dominiodelle frequenze  m/z

41. Analizzatore di massa a ICR FT • Massimo valore m/z > 50 000 • Risoluzione fino a 106. • Possibilità di intrappolare gli ioni. • Massima accuratezza nella determinazione delle masse. • Semplicità nel passaggio da ioni positivi a ioni negativi. • Prezzi ancora proibitivi per molte applicazioni (500 –1 400 k€)

42. Separazioni multidimensionali 2D-PAGE: separazione bidimensionale ortogonale IEF + SDS PAGE Il risultato è evidentemente una separazione bidimensionale. I due processi separativi si sviluppano ortogonalmente Domande: - Tutti gli accoppiamenti fra tecniche separative danno origine a separazioni multidimensionali? - Come si definisce l’ortogonalità di due tecniche separative?

43. Separazioni multidimensionali Tecniche correlate e non correlate Tecniche “ortogonali” Tecniche correlate

44. Separazioni multidimensionali a b c+d a+b c d Accoppiamento di due colonne LC basate su principi diversi Accoppiamento “in tandem” 1) Il risultato che si ottiene è un cromatogramma monodimensionale 2) La separazione ottenuta nella prima colonna può essere distrutta nella seconda. Non è una separazione bidimensionale

45. Separazioni multidimensionali Per realizzare l’accoppiamento bidimensionale fra due colonne cromatografiche (o altre tecniche separative a flusso) è necessario un dispositivo che isoli le frazioni ottenute in prima separazione, in modo che non possano mescolarsi durante la seconda separazione. Il risultato è una mappa cromatografica bidimensionale

46. Separazioni multidimensionali Definizioni classiche (Giddings) Una separazione si definisce multidimensionale se soddisfa le seguenti due condizioni: • Il meccanismo di separazione di ciascun passaggio deve essere “ortogonale” agli altri. • La separazione ottenuta in ciascun passaggio non deve essere perduta nei passaggi successivi.

47. Separazioni multidimensionali Multidimensionalità e tecniche accoppiate • Il concetto di multidimensionalità è estendibile alla combinazione fra tecniche separative e tecniche di rivelazione. Convenzionalmente si definiscono: • Coupling (accoppiamento): combinazione tra più tecniche separative (es. LC-GC) • Hyphenation (ifenazione): combinazione tra una tecnica separativa e un rivelatore o tecnica di caratterizzazione (es. GC-MS, LC-UV)

48. Separazioni multidimensionali FFF-FL: tecniche ifenate ortogonali ex 325 nm Void (463 nm) NPs (525 nm) Elution Time (min) em (nm) FFF e fluorescenza sono ortogonali perché la separazione avviene in base a proprietà dimensionali, non correlate alle proprietà spettroscopiche

49. Separazioni multidimensionali Una deviazione dalla correlazione evidenzia una variazione confromazionale FFF-MS: tecniche ifenate correlate Dai valori di tr in FFF Dai valori di m/z in MS

50. Separazioni multidimensionali Definizione generale di multidimensionalità • Si definisce multidimensionale la combinazione di tecniche il cui risultato sia la “dislocazione” dell’informazione rispetto a più di una variabile. Il segnale analitico può essere rappresentato come una funzione di almeno due variabili di dislocazione. Dislocazione tempo volume λ distanza massa m/z potenziale