William Ritchie, TAGC INSERM, Marseille

1. William Ritchie, TAGC INSERM, Marseille The ATD project is funded by the European Commission within its FP6 Programme, under the thematic area "Life sciences, genomics and biotechnology for health", contract number LHSG-CT-2003-503329

2. Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets • Courts ARNnc (20-25 nt) qui servent de régulateurs post-transcriptionnels • Issus de mRNAs de plus grande taille (60-90) : qui forment des tiges boucles: pre-miRNA

3. Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets Mir-124 Mir-1 • Plant miRNA: clivage des mRNA • Animal miRNAs: repression de la traduction • Lim et al. (2005): dans le model animal les miRNAs peuvent abaisser le niveau des messagers

4. Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets • Se fixent sur la région non traduite du 3’ (UTR) CDS CDS • Comment sont affectés les niveaux d’expression si une forme est ciblée et une autre ne l’est pas ? • Trouver des gènes qui possèdent au moins deux isoformes dont une (la plus longue) a une cible de miRNA (dans l’UTR 3’) et l’autre n’en a pas.

5. Human Mouse Chicken Rat Dog Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets • la reconaissance de la cible par le miRNA implique souvent une courte séquence 6-8 nt hautement conservée apellé « seed » • En utilisant les données d’Ensembl un assemblage de 3495 UTRs conservés (human, mouse, dog, rat) est crée • Recherche de toutes les sequences de 7nt sequences parfaitement conservés: cibles potentielles de miRNA

6. % of total ESTs « Non-targeted » isoforms « targeted » isoforms Non-targeted isoforms targeted isoforms Control Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets • En utilisant des comptages d’EST on compare le niveau d’expression des isoformes ciblées et des isoformes non ciblées P=0.38 P=7e-5 • Les isoformes ciblées ont un niveau d’expression plus élevé !!!

7. a Relative isoform expression (%) Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets • Mais n’y a-t-il pas un effet tissu spécifique ? • evoc ontology (v26) MiR-1 MiR-124a nt t nt t nt t nt t Non Cardiovascular Cardiovascular Brain Non Brain

8. 25 MiR-124a MiR-1 30 20 25 15 20 1/p.value 1/p.value 10 15 10 5 5 0 0 lym - brain res - uro - mus ali - car - en - der pho - pira - geni - cu - men - dio - do - mal lym brain res uro mus Ali car En der - - - - - - reti tory tal los tary vas crine - - - pho pira geni cu men dio do mal - - - - - - - reti tory tal los tary vas crine - - - Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets 31 10 15 43 29 61 39 84 16 11 <10 25 35 <10 <10 19 26 42

9. Disrep Cible potentiel de miRNA • 10 genes • 3 types tissulaires differents Tissu 1 Tissu 2 Tissu 3 Tous tissus P>0.05 P>0.05 P<0.05

10. 14640 distinct motifs (373,948 sites) Four-way Conserved 7-mers in 3’ UTRs 9334 motifs 7-mers in 10 mRNAs and 3 tissues Motif present downtream of 1st polyA site + Differential Isoform Repression test (p<0.05) DISREP: 312 motifs Total motifs MiRNA targets PUF protein fixation site ARE 7-mers conserved in 4 species (>10 genes, > 3 tissues) 9334 260 46 4 After Disrep 312 29 8 2 p-value enrichment 1.0 e -8 1.2 e -4 6.4 e -3 Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets

11. 16% 45 Disrep 14% Shuffle 12% 312 10% 29.6 Proportion of targets for Known miRNAs in motifs (%) 261.2 760 8% 710.1 3832.1 6% 3810 4% 2% 0% < 0.01 < 0.05 < 0.1 < 0.5 p-value for differential repression of targeted isoforms Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets

12. 9334 motifs 7-mers dans 10 mRNAs et3 tissus Motif present downtream of 1st polyA site + Differential Isoform Repression test (p<0.05) DISREP: 312 motifs Trouver les 7-mers complementaires dans le genome Extraire +/- 80 nt Energie de repliement < -45Kcal Hits de Megablast dans souris+rat+chien, avec la seed 100% conservée Four-way multi alignment + RNAZ p-value > 0.99 + Criteres de structure et séquence 456 miRNA precursors 213 miRNA precursors (211 miRNAs) Clustering des precurseurs chevauchants et elimination de ceux qui touchent au codant Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets 45 in miRNA registry 38 predicted by recent studies 128 novel precursors

13. Et les cibles qui ne correspondent pas a des precurseurs de miRNA • Certaines cibles ne correspondent pas a des precurseurs potentiels • Peut etre des sites de fixation d’un autre type d’ARNnc • Longueur inconnue, structure inconnue • Rechercher des motifs conservés et strusturéc

14. Et les cibles qui ne correspondent pas a des precurseurs de miRNA • Alignements tout génome l'UCSC en utilisant des chaines de Markov et un filtre synthenie (homme,souris,chien,rat + zebrafish ou fugu) • 5' UTR, 3' UTR, Intron, Intergenique • Recherche de regions conservées • Conservation d'une structure (RNAz p>0,9) • Clustering hierarchique des differentes structures

15. RNAforester

16. Trop de branches tue la branche !!

17. Trop de branches tue la branche !!