Interacciones microorganismos - planta

1. PRÁCTICO N° 5 Interacciones microorganismos - planta Objetivo: Conocer las técnicas de laboratorio para el manejo de microorganismos que interactúan con las plantas Interacciones más comunes • Positivas (sinérgicas) • Simbiosis (micorrizas, rizobios) • Mutualismo (Azozpirillum) • Negativas (antagónicas) • Competencia • Amensalismo • Aislamiento de microorganismos • Selección de cepas • Producción de inoculantes Técnicas de laboratorio

2. Simbiosis: micorrizas Ectomicorrizas Endomicorrizas Intercelulares Manto externo Raíz modificada Hongos superiores Cultivables Intercelulares e intracelulares Sin manto externo Sin raíz modificada Hongos inferiores No cultivables

3. nódulos seleccionar nódulos turgentes extraer los nódulos lavar cortar la raíz 1 ml de H2O estéril macerar enjuagar con H2O estéril desinfectar con H2O2 (5minutos) incubar colorear (Gram -) estriar en medio YEM incubar conservar repicar (pico de flauta) Aislamiento de microorganismos: rizobios

4. Aislamiento de microorganismos: rizobios Extraer los nódulos Raíz de leguminosa Desinfectar con H2O2 (20%) 5 minutos Enjuagar con H2O estéril

5. Aislamiento de microorganismos (rizobios) Colocar los nódulos en un tubo con 1ml de agua estéril Macerar con varilla de vidrio Incubar (28-30° C) Estriar en medio YEM Extraer una alícuota

6. Aislamiento de microorganismos (rizobios) Colorear y observar Cultivo de rizobio Incubar y conservar Repicar a “pico de flauta”

7. nódulos seleccionar nódulos turgentes extraer los nódulos lavar cortar la raíz 1 ml de H2O estéril macerar enjuagar con H2O estéril desinfectar con H2O2 (5minutos) incubar colorear (Gram -) estriar en medio YEM incubar conservar repicar (pico de flauta) Síntesis de aislamiento de rizobios

8. 1 g de raíz colocar en H2O estéril y agitar cortar raíz lavar incubar sembrar en medio NFB semisólido extraer alícuota crecimiento de Azospirillum incubar colorear (Gram -) aislamiento en medio NFB sólido incubar conservar repicar (pico de flauta) Aislamiento de microorganismos: Azospirillum

9. Aislamiento de microorganismos: Azospirillum Gramínea Cortar raíces Suspender en H2O estéril Extraer alícuota Agitar

10. Aislamiento de microorganismos: Azospirillum Incubar Sembrar en medio NFB semisólido Halo de crecimiento de Azospirillum Repicar a “pico de flauta" Incubar y conservar

11. 1 g de raíz colocar en H2O estéril y agitar cortar raíz lavar incubar sembrar en medio NFB semisólido extraer alícuota crecimiento de Azospirillum incubar colorear (Gram -) aislamiento en medio NFB sólido incubar conservar repicar (pico de flauta) Síntesis de aislamiento de Azozpirillum

12. Selección de cepas para capacidad fijadora de N Ensayo de laboratorio: alfalfa Medio de cultivo: Yensen Testigo: medio sin N sin inocular Control: medio sin N inoculado con cepa eficiente Tratamientos: medio sin N inoculados con cepas a testear Testigo: medio con N sin inocular

13. Testigo medio sin N sin inocular Control medio sin N inoculado con cepa eficiente Tratamientos medio sin N inoculados con cepas a testear Testigo medio con N sin inocular Síntesis de selección de cepas

14. Selección de cepas: parámetros de evaluación • Cantidad de nódulos • Color • Posición en la raíz • Actividad Nasa • N en planta • Peso de raíz

15. Primera etapa cultivo de iniciación (pie de cuba) incubar (4-5 días) 50 ml extraer una alícuota de cultivo conservado cultivar en medio YEM liquido (pie de cuba) colorear (control del pie de cuba) filtro de aire manguera • agregar antibiótico • colocar el pie de cuba Segunda etapa cultivo a gran escala (biodigestor) aireador cámara de aire 30% colorear (control del inoculante) incubar 3 o 4 días Síntesis de producción de inoculante Medio Ashby (estéril)

16. Producción de inoculantes Mangueras Tapones Biodigestores Filtro de aire Mechero Aireador

17. Producción de inoculantes Planta Industrial

18. Actividades • Micorrizas: observar raíces de pino • Rizobios: observar bacteroides y bacterias • Producción de inoculantes: observar un biodigestor