ANTIGÉN, ELLENANYAG

1. ANTIGÉN, ELLENANYAG • immunogenitás, tolerogenitás • antigén fogalma • epitop (B-, T-sejt epitop) • haptén • hordozó • antigén prezentáció • T independens antigének • szuperantigének • immunoglobulinok • ellenanyag szerkezete • izotípusok • ellenanyagok funkciói • poliklonális és monoklonális ellenanyagok • passzív immunizálás • humanizált ellenanyagok • ellenanyagok felhasználása • gyakorlat: • monoklonális ellenanyag termelő hibridóma sejt előállítása • sejtszámolás • gyorsklónozás • ellenanyagok tisztítása affinitás oszlopon

2. ANTIGÉN IMMUNOLÓGIAI FOGALOM Az adaptív immunválasz fogalomkörébe tartozik, B-, T-limfociták, antigén receptorok, ellenanyagok kapcsán beszélünk antigénről. Szinte bármilyen kémiai szerkezet ((de olyan anyagok amik képesek fehérjékkel másodlagos kémiai kötést kialakítani!)) Oldott vagy részecske természetű Egyszerű vagy összetett Szervezetben képződő vagy külső környezetből bejutó Genetikailag saját vagy nem saját Természetes vagy mesterséges

3. Definíciók • Antigén (Ag) - bármely olyan anyag, amelyet az érett immunrendszer felismer és vele szemben specifikus, fajlagos módon reagál. • Antigenitás: • immunogenitás – az antigén képessége az (adaptív) immunválasz beindítására • tolerogenitás – az antigén képessége az immunológiai tolerancia kiváltására, specifikus „immun-nemválaszolás” • Ilyenek pl. a saját fehérjék

4. Az immunogenitást befolyásoló tényezők I. • Idegen-saját (immunogén-tolerogén) • Méret/komplexitás (nagyobb antigénen több „dolgot” lehet felismerni) • Genetikai háttér • faji hovatartozás (filogenetikai távolság: rokon fajoknak hasonlóak a fehérjéi) • egyéni különbségek (pl. MHC molekulák eltérései) • Életkor (újszülött – még nincsenek reagáló sejtjei, időskor – nem képződnek új limfociták) • Fizikai állapot (pl. immunodefficiencia, éhezés)

5. Az immunogenitást befolyásoló tényezők II. • Dózis • Bevitel módja és útja • Intradermális/szubkután > intravénás > orális > intranazális (a sorrend függ az antigéntől is!) • Adjuvánsok • fokozzák az immunrendszer antigén ingerre adott válaszát • pl: aluminiumsók, Freund-adjuváns, TLR ligandumok • AZ ADJUVÁNS HATÁS ÖSSZETETT: • - depó hatás  az antigén hosszantartó jelenléte • - a természetes immunitás aktiválása • - járulékos sejtek aktivációja

6. Az immunogenitást befolyásoló tényezők III. • Az antigén fizikai sajátságai • - részecske (sejt, kolloid)vagy oldott („hordozó”/méret) • - denaturált vagy natív (epitopok) • Lebonthatóság • - antigénprezentáció APC által • Hozzáférhetőség (szemlencse fehérjék elzártak az immunrendszertől)

7. (animált ábra) Antigén Antigén: amit az immunrendszer felismer, és vele specifikus módon reagál Antigén determinánsok avagy epitopok: az antigén azon részei amihez az antigén receptorok vagy az antigén specifikus ellenanyagok közvetlenül kötődnek

8. Antigén determináns (epitop) Az antigénnek az antigén receptorhoz közvetlenül kapcsolódni tudó része Az antigén azon része, melyet egy meghatározott immunglobulin (B sejt receptor vagy ellenanyag) vagy T sejt receptor ismer fel.

9. B sejt epitop T sejt epitop (B sejtek ismerik fel) fehérjék szénhidrátok lipidek DNS szteroidok stb. - mesterséges vegyület is lehet! szöveti vagy oldott (T sejtek ismerik fel) peptidek (8-23 aminosav) (szigorú méretbeli kötöttség!) APC által történő bemutatás szükséges (MHC molekulákon) glikolipidek, lipopeptidek - MHC szerű CD1 molekulák segítségével mutatja be az APC. A T sejtek néhány százaléka ismer fel ilyen antigént.

10. A KOMPLEX ANTIGÉNEK ELVI FELÉPÍTÉSE Antigén determináns (avagy epitop) az antigén azon része, amelyet egy adott immunglobulin (B-sejt receptor, ill. ellenanyag), vagy T-sejt receptor felismerni képes Hordozó az immunglobulinnal vagy T-sejt receptorral közvetlenül nem reagáló rész Ezek a fogalmak csak az antigén és egy adott immunglobulin vagy T-sejt receptor viszonylatában értelmezhetők! A hordozó fogalmát főleg vakcinákkal kapcsolatban használják

11. (animált ábra) Epitop és „hordozó” Ellenanyag 1. „hordozó” (2.) Ellenanyag 2. Epitop 1. Epitop 2. „hordozó” (1.) Antigén

12. (animált ábra) CD4+ Helper T sejt CD8+ Citotoxikus T sejt Az antigén bemutatás vázlatos folyamata Exogén fehérjék MHC I MHC II APC Endogén fehérjék Az MHC molekulák chaperonnak tekinthetők, amik az antigénből származó (konformáció nélküli) peptid fragmentumot elnyújtott, stabilizált, bemutatható állapotban tartják a prezentáló sejt felszínén.

13. AZ ANTIGÉN DETERMINÁNSOK TÍPUSAI lineáris determináns konformációs determináns (TCR, BCR, Ig) (BCR, Ig) konformációs determinánsok Ab2 Ab1 sejtfelszíni/hozzáférhető determináns hasítás denaturáció rejtett/feltárt determináns új/neoantigén determináns konformációs/lineáris determinánsok WB  SDS hatására eltűnhet a konformációs determinánsok egy része, de előkerülhetnek rejtett determinánsok

14. Az LPS antigén vagy PAMP/DAMP? PAMP ha mintázat felismerő receptor ismeri fel Antigén ha antigénreceptor v. ellenanyag ismeri fel TLR4 TLR4 Az LPS molekula egy glökózamin epitopját specifikusan felismerő ellenanyag LPS LPS MD2 MD2 Fc LPS Fab Fab MD2 TLR4 LPS LPS TLR4 MD2

15. A B sejtek antigén általi aktivációja gyakran csak segítő T sejtek jelenlétében lehetséges Mindkét sejt aktivációjával jár antigén CD40 CD40L citokinek B sejt aktiváció, memória Vannak olyan antigének (pl. poliszaharidok) amik nem prezentálódnak

16. A B SEJTEK AKTIVÁLÁSA A T SEJTEK KÖZREMŰKÖDÉSE NÉLKÜL – „Tímusz independens antigének” T INDEPENDENS ANTIGÉN TI-1 T INDEPENDENS ANTIGÉN TI-2 B SEJT Az antigén különböző részei a BCR-hez és más sejtfelszíni receptorokhoz (pl. LPS-kötő receptor /CD14) egyidejűleg kötődnek Sűrűn elhelyezkedő, ismétlődő, azonos epitópok (pl. szénhidrát komponensek a mikroorganizmusok falában) BCR keresztkötéseket hoznak létre B SEJT AKTIVÁCIÓ (extra aktivációs szignál) (extenzív receptor aggregáció)

17. Gyakorlati példa (pl. Prevenar - pneumokokkusz vakcina) Glu  Gly toxoid toxin toxoid toxoid pneumokokkuszból származó poliszaharidok Baktériumok elleni immunizálásnál problémát jelent, hogy a vakcinában felhasználandó tisztított bakteriális poliszaharidok nem aktiválnak T sejteket, így nem jön létre memória B sejt válasz Ezért sok poliszaharid vakcinában a cukorláncokat immunogén fehérjéhez konjugálják, hogy T sejt dependens választ tudjon kiváltani. Egy ilyen célra használt fehérje a CRM197  módosított diftéria toxin (toxoid) (az eredeti fehérje egy aminosavát kicserélték (Glu  Gly) ami így nem toxikus) A toxoid megőrzi az immunogenitását és önmagában is képes lehet toxin ellenes blokkoló antitestek indukciójára.

18. poliszaharidot felismerő memória B sejtek ( ellenanyag termelő effektor sejtek) A poliszaharid epitopot felismerő B sejt képes a hordozó fehérje peptidjeit prezentálni a T sejteknek toxoidból származó peptid toxoid poliszaharid MHCII TCR BCR segítő T sejt B sejt citokinek, CD40-CD40L

19. HAPTÉNEK Kis méretű molekulák, amelyek önmagukban nem képesek immunválaszt indukálni (pl. gyógyszerek, reaktív vegyületek) - haptén (i.e. DNP: dinitrofenil) 1. + hordozó + haptén 2. + haptén immunizált

20. A HORDOZÓHOZ KÖTÖTT HAPTÉNEK ELLEN IRÁNYULÓ ELLENANYAGOK TÍPUSAI hordozó+haptén ellenanyag/antitest hordozó specifikus haptén specifikus hordozó+haptén specifikus

21. SZUPERANTIGÉNEK Olyan mikrobiális fehérjék, melyek APC jelenlétében több – megfelelő TCR-t hordozó – T-sejthez tudnak kötődni és aktiválják azokat, s ezáltal poliklonális aktiválást eredményeznek

22. SZUPERANTIGÉNEK .

23. Szuperantigének • Fehérjék, melyek több – megfelelő TCR-t hordozó – T-sejthez tudnak kötődni és aktiválják azokat. Konvencionális Antigén Szuperantigén Monoklonális/Oligoklonális T sejtválasz 1:104 - 1:105 (107 / 1011 Poliklonális T sejt válasz 1:4 - 1:10 1010 / 1011) aktivált T sejt

24. Azimmunglobulinokszerkezete és funkciója

25. Immunoglobulinok(glikoproteinek) • Mobilitás alapján gamma-globulin • Immunológiai funkció alapján • antigén-specifikus fehérjék • B sejt membránban antigén felismerő • receptor BCR – B sejt receptor • Testfolyadékokban (pl. szérum) • ellenanyagok, antitestek

26. diszulfid híd szénhidrát CL VL CH2 CH3 CH1 kapocs régió VH Fc receptorhoz kötés Az immunoglobulin szerkezete • Könnyű és nehéz láncok(ember, egér) • Diszulfid hidak • láncok közötti • láncon belüli komplement aktiváció • Variabilis és konstans régiók • Kapocs régió • Domének • VL & CL • VH & CH1 - CH3 (CH4 pl. IgM) • Oligoszaharid

27. HIPERVARIÁBILIS RÉGIÓK könnyű lánc hipervariábilis régiója könnyű lánc nehéz lánc nehéz lánc hipervariábilis régiója

28. Ribbon structure of IgG

29. antigén-kötés komplement kötőhely kötődésaz Fc receptorokhoz placentális transzfer Az immunglobulinok enzimes hasítása segített a szerkezet és funkció sajátságainak vizsgálatában

30. Papain VH VL Immunoglobulin fragmentek: Struktúra/Funkció összefüggések • Fab • Ag kötés(valencia=1 monovalens) • Specificitást a VH és a VL domének határozzák meg • Fc • Effektor funkciók Fc Fab

31. Immunoglobulin fragmentek: Struktúra/Funkció összefüggések • F(ab’)2 • Antigén kötésbivalens!valencia=2 Pepszin Fc peptidek + F(ab’)2 Az effektor funkciók egy részét nem képes indukálni, de képes lehet pl. agglutinációra/precipitációra

32. az F(ab’)2 fragmentumképes • felismerni az antigént • precipitálni az antigént (bivalencia!) • blokkolnia toxinokvagy patogénnel asszociált molekulák aktív helyét (neutralizáció) • blokkolnia gazdasejt és a patogénnekmolekuláiközötti kölcsönhatásokat (neutralizáció) de Fc régió hiányában nem képes aktiválni • sejtekkelkapcsolatos gyulladásos és effektor funkciókat • a komplement rendszer gyulladásos és effektor funkcióit • fagocitózist és az azt követő antigén prezentációs folyamatokat Miért szükséges az Fc régió?

33. OSZTÁLY/ALOSZTÁLY ANTIGÉNKÖTŐ HELY A H- és L-lánc variábilis (V) régióinak egyedi szekvencia variabilitása (klón-specifikus) (Ez felel a sokféle antigén specifikus megkötéséért!) A H-lánc (nehézlánc) konstans régiójának típusai, eltérő aminosav szekvencia Ig osztályok: IgG, IgA, IgE, IgD, IgM;alosztályok: IgA1-2, IgG1-4 (könnyűlánc izotípusok: κ, λ) A konstans szekvenciákban található allélikus változatok IgG – Gm allélek Egyeden belüli különféle antigéneket felismerő változatok Egyeden belüli típusok Egyedek közötti változatok

34. Humán Immunglobulin Osztályok • IgG - gamma () nehézláncok • IgM - mü () nehézláncok • IgA - alfa () nehézláncok • IgD - delta () nehézláncok • IgE - epszilon () nehézláncok Izotípusok! könnyűlánctípusok • kappa () • lambda ()

35. Szabad IgM pentamer (”csillag”) Antigénhez kötött IgM (”rák”)

36. ELLENANYAGOK IZOTÍPUSAINAK JELLEMZÉSE 2.

37. Izotípusok a primer és szekunder immunválasz során ellenanyagszint szekunder válasz az A antigénnel szemben primer válasz az A antigénnel szemben primer válasz a B antigénnel szemben napok

38. Az ellenanyag termelés az első és a második immunválasz során második X-ellenes válasz X-antigén X-antigén első X-ellenes válasz növekvő szérum ellenanyag titer hetek Tulajdonság első válasz második válasz B-sejt típus A B-sejt antigénnel való találkozásáig eltelt idő Az antigénnel való találkozás és a válasz csúcspontja között eltelt idő 100-1000x erősebb az első válasznál antigénfüggő Az ellenanyagtermelés mértéke A termelt izotípusok magas alacsony Ellenanyag affinitás

39. Izotípusváltás a B-sejt fejlődése során

40. ANTIGÉNKÖTÉS

41. Az antigén determináns és az ellenenyag antigénkötő ”zsebe” közötti kölcsönhatás elve

42. Az „Fab-lizozim” komplex röntgenkrisztallográfiás képe A különválasztott komponensek felszíni képe. Piros szín jelzi az Fab-lizozim komplex kölcsönhatásban résztvevő oldalláncait.

43. HIPERVARIÁBILIS RÉGIÓK könnyű lánc hipervariábilis régiója könnyű lánc nehéz lánc nehéz lánc hipervariábilis régiója

44. Complementary Determining Region (CDR) Variábilitás (a különböző aminosavak száma) aminosav pozíció az Ig-lánc szekvenciájában

45. Az ellenanyag-antitest kötődés jellemzése Valencia: az antitestnek az antigénnel kialakított kapcsolatainak száma Affinitás: egy adott antigén és antigénkötő hely kapcsolatának erőssége Aviditás: az adott antitest összes kötőhelye affinitásainak „eredője” (nem az összege) sztérikus hatás

46. Az antigén kötés önmagában védő funkciót láthat el: NEUTRALIZÁCIÓ sejtkárosodás vírusok, baktériumok, toxinok (bakteriális, rovar v. kígyóméreg) sejtvédelem

47. KÖTŐDÉS AZ Fc-RECEPTOROKHOZ

48. (A) A nagy affinitású Fc-receptor a sejt felszínén monomer Ig-t köt, mielőtt az az antigénhez kapcsolódna. (pl. FceR– IgE) (B) A kis affinitású Fc-receptor a már multivalens antigénhez kapcsolódó Ig-katköti meg. (pl. FcγR – IgG) FcR – IgE Effektor sejt aktiválás komplex antigén FcgR – IgG+Ag Effektor sejt aktiválás ellenanyag kötődve a komplex antigénhez ellenanyag

49. OPSZONIZÁLÁS FAGOCITÓZIS OPSZONIN NÉLKÜL OPSZONINNAL IDŐ IDŐ fagocitózis fagocitózis

50. - AntibodyDependentCellularCytotoxicity (ADCC) A célsejt apoptózissal elhal Az Fc-receptor keresztkötések aktiválják az NK sejt ölőmechanizmusait Az ellenanyag kötődis a sejtfelszíni antigénhez Az NK sejtek receptorai érzkelik a kötött ellenanyagokat (NK SEJT DEGRANULÁCIÓ) Citotixikus granulumok tartalmának ürítése membránkárosodás és nekrózis a patogén puszulásához vezet nagyméretű patogén ellenanyaggal borítva - Komplement aktiváció (következő alkalommal)