Diplomarbeit Sören Werner

1. Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000 Diplomarbeit Sören Werner Betreuer: Prof. Dr. rer. nat. habil. Th. Bley Prof. Dr.-Ing. D. Eibl Dr. rer. nat. D. Grimmecke

2. 1 Einleitung • Escherichia coli Wildstamm mit weitestgehend unbekannter Physiologie • Bisher identifizierte Eigenschaften liefern Anhaltspunkte für eine mögliche probiotische Nutzung zur Prävention und Akutbehandlung entzündlicher Darmerkrankungen • Gestiegene Anzahl antibiotikaresistenter Krankheitserreger stärkt das Marktpotential probiotischer Pharmakons in Human- und Veterinärmedizin • Zusätzlich sind Nebenwirkungen von Antibiotika unerwünscht • Ziel→ Kultivierung des Stammes mit einer hohen Zelldichte und einer Anpassung an das Milieu „Verdauungstrakt“

3. 2 Theoretischer Überblick • Escherischia coli • Fakultativ anaerobes, gramnegatives, stäbchenförmiges, nichtsporenbildendes und peritrisch begeißeltes Bakterium aus der Familie der Enterobacteriaceae • Medizinische Mikrobiologie unterscheidet kommensale, nichtpathogene und pathogene Stämme • Diagnostische Differenzierung beruht auf der serologischen Einteilung von Kauffmann nach O-, H- und K-Antigen

4. 2 Theoretischer Überblick • Wachstum von E. coli • Heterotrophe Mikroorganismen → Energie aus Oxidation energiereicher organischer Verbindungen • Bei E. coli Kohlenhydrate, organische Säuren oder Aminosäuren als Energie- und Kohlenstoffquelle • Ammoniumverbindungen oder Aminosäuren als Stickstoffquelle • Makroelemente wie Magnesium, Kalium, Eisen und Phosphor essentiell • Mikroelemente wie Bor, Mangan, Kupfer, Cobalt, Molybdän in spezifischen Funktionen

5. 2 Theoretischer Überblick • Stressantwortvon E. coli • Allgemeine Stressantwort geregelt durch alternativen s-Faktor S → veränderte RNA-Synthese • Säurestressantwort durch Bildung biogener Amine aus korrespondierenden Aminosäuren → dadurch Verbrauch eines Wasserstoffions • Aminosäure/Amin-Paare: Glutaminsäure/g-Aminobuttersäure (GABA), Arginin/Agmatin/Putrescin, Ornithin/Putrescin und Lysin/Cadaverin

6. 3 Material und Methoden • Kultivierungen • Komplexes Nährmedium (Pepton) anaerob in Schüttelkultur (37 °C, 150 rpm, pH-ungeregelt) • Komplexes Nährmedium (Pepton, LB) aerob im 15L Bioreaktor von Braun (37 °C, 400-800 rpm, 1-2 vvm, pH 6,8) • Wachstum, Substratverbrauch und Produktbildung aufgezeichnet • Bildung biogener Amine als Zeichen der Stressadaption durch HPLC-Analyse ermittelt → Physiologie in Bezug auf Stressantwort und Wachstum • Nach Medienoptimierung Validierung des Mineralmediums durch Versuche in Analogie zu Komplexmedium

7. 3 Material und Methoden • Medienoptimierung • Ableitung chemisch definiertes Mineralmedium aus Erkenntnissen von Wachstumsversuchen und Literaturangaben • Optimierung in einem Mikrotiterplattenphotometer (Thermo Electron) • Mineralmedium aus Glucose, Ammoniumchlorid, Phosphatpuffer, Magnesiumsulfat und Spurenelementen

8. 3 Material und Methoden • Analysen • Zellzahl und Biotrockenmassekonzentration über Korrelation zur optischen Dichte ermittelt • Medienbestandteile mit Bioprofile 300 (Nova Biomedical) untersucht • Konzentration biogener Amine und korrespondierender Aminosäuren mittels HPLC (Dionex) bestimmt

9. 4 Ergebnisse • Komplexmedium anaerob • Wachstum bis zu einer Zelldichte von 0,35 g·L-1 • pH-Wert sinkt auf 4,0 • Glucoseverbrauch von insgesamt 2,5 g·L-1 (teils auch nach Wachstumsstop) → Metabolismusaktivität • Acetat- und Ethanolausschüttung (1,3 g·L-1 bzw. 0,35 g·L-1) auch nach Wachstumsstop • Aminausschüttung equimolar und zeitgleich zu Aufnahme von Aminosäuren als Zeichen der Säurestressantwort

10. 4 Ergebnisse • Komplexmedium aerob • Wachstum bis zu einer Zelldichte von 2,5 g·L-1 • pH-Wert geregelt (pH 6,8) • Hohe Acetatausschüttung (1,3 g·L-1) trotz ausreichender Sauerstoffsättigung aufgrund hoher Glucosekonzentration (36 g·L-1) • Ausschüttung von Cadaverin und Putrescin trotz physiologischem pH-Wert • Keine Bildung von g-Aminobuttersäure und Agmatin

11. 4 Ergebnisse • Medienentwicklung und -optimierung • pH-Wert ungeregelt • optimales Wachstum bei Glucosekonzentration von 7,2 g·L-1 • Ammoniumchlorid als bevorzugte Stickstoffquelle • Aminosäuren mit teils negativen Auswirkungen • Zugabe von Vitaminen nahezu ohne Einfluss auf Wachstum

12. 4 Ergebnisse • Mineralmedium anaerob • Wachstum bis zu einer Zelldichte von ca. 0,15 g·L-1 • pH-Wert sinkt auf 4,0 • Keine Stressantwort in Form von biogenen Aminen nachweisbar • → unbekannte Cofaktoren müssen analysiert werden

13. 4 Ergebnisse • Mineralmedium aerob • Wachstum bis zu einer Zelldichte von 5 g·L-1 • pH-Wert geregelt (pH 6,8) • Kaum Acetatausschüttung • Vollständiger Verbrauch von Glucose (7,2 g·L-1) • Parameter: µmax=0,79 h-1 , YX/Gluc=0,76 g·g-1, KGluc=0,003 g·L-1, YX/NH4+=0,13 g·mmol-1

14. 4 Ergebnisse • Aerobe fed-batch-Strategie • Wachstum bis zu einer Zelldichte von 60 g·L-1 • pH-Wert geregelt (pH 6,8) • Acetatausschüttung bei Limitierung durch Sulfatmangel (Stunde 18) • Ausschüttung von Cadaverin, Putrescin und g-Aminobuttersäure trotz physiologischem pH-Wert • → teilweise konstitutive Bildung • Weitere Parameter: YX/PO43+=3,55 g·mmol-1, YX/SO42+=14 g·mmol-1

15. 5 Fazit • Zusammenfassung • Ausgeprägte Stressantwort durch Biosynthese biogener Amine im Komplexmedium unter anaeroben, nicht pH-geregelten Bedingungen • Aufnahme von Aminosäure und Export der korrespondierenden Amine nahezu equimolar und zeitgleich • Unter aeroben, pH-konstanten Bedingungen keine Beziehung • Medienoptimierung im Mikrotiterplattenphotometer ist ressourcenschonend • Optimale Glucosekonzentration 7,2 g·L-1 • Mineralmedium mit gutem aerobem Wachstum • Säurestressantwort auch bei Zugabe der benötigten Precursoren kaum vorhanden • Bei höheren Zelldichten (fed-batch bis 60 g·L-1) unter pH-konstanten Bedingungen Bildung von Aminen → teils konstitutiver Charakter

16. 5 Fazit • Ausblick • Säurestressantwort im Mineralmedium • Assay zur Bestimmung der allgemeinen Stressantwort (ss) • Vitalitätsbestimmung • Verbesserte Prozessführung mit online-Messung

17. Danke für Ihre Aufmerksamkeit Offene Fragen?