CAT

1. CAT DNA-ANALYSE VIA FLOWCYTOMETRIE APR. INGE THOELEN U.Z. LEUVEN, 3 MEI 2005

2. WAT? • Analyse DNA-inhoud • DNA-aneuploïdie: • Diploïd: 46 chromosomen • Hyperdiploïd: > 46 chromosomen • Hypodiploïd: < 46 chromosomen • Maligne cellen: numerische en structurele chromosomale aberranties • DNA-analyse: enkel numerische aberranties! • ≠ fasen celcyclus: G1, S, G2 → %S-fase fractie (tumor-proliferatie)

3. HOE? • Staal: beenmerg, bloed, weefselbiopten • Isoleren en kleuren celkernen m.b.v. CycleTEST PLUS DNA reagens kit (BD): • Lyseren RBC (RCLB, zelfbereid) • Oplossing A: detergent, trypsine • Oplossing B: trypsine inhibitor, RNase • Oplossing C: propidium jodide (intercalator) • Vervolgens flowcytometrische analyse (FACSCalibur, BD) • Auto-analyse resulterende DNA-histogram met ModFit LT® software

4. PRINCIPE FLOWCYTOMETRIE FACScalibur (BD) Sample Sheath fluid Argon Laser

5. DNA FLOWCYTOMETRIE PI Fluorescentie detector 488 nm 620 nm Amplifier 1 256 Multichannel pulse height analyser

6. DNA-HISTOGRAM

7. DNA-HISTOGRAM De DNA-index (DI) is de ratio van de gemiddelde relatieve DNA-inhoud van de G1-cellen van de patiënt en de gemiddelde relatieve DNA-inhoud van de diploïde G1-referentiecellen. Cellen met een normaal diploïd karyotype hebben per definitie een DI=1.

8. ANALYTISCHE PERFORMANTIE • # events > 10.000 • CV diploïde piek ≤ 3% • % B.A.D. (debris/aggregaten) < 20% • (Reduced Chi-Square (RCS): goodness of fit) • 1,0 tot 3,0: goed • 3,0 tot 5,0: matig • > 5,0: slecht Prout’s Neck DNA Cytometry Consensus Conference guidelines, USA 1992 (Shankey et al., 1993)

9. WAAROM? • Ploïdie-status blasten is prognostische indicator in acute lymfoblastische leukemie (ALL) • DNA-index opgenomen in risico-classificatie criteria pediatrische ALL(< 18 jaar) • Behandeling verschillend naargelang risicogroep • Kinderen met zeer laag risico op recidief: minder intensieve en minder toxische therapieschema’s; zeer hoog risico-ALL: aangepaste en aggresievere therapie

10. ACUTE LYMFOBLASTISCHE LEUKEMIE • Systemische, neoplastische proliferatie van lymfoblasten • +/- 70% van de gevallen: patiënten < 17 jaar • ALL meest voorkomende vorm van kanker bij kinderen: +/- kwart van de kankerdiagnoses • Acute leukemie bij kinderen: ALL/AML → 5:1 • Genezingskans pediatrische patiënten: 80% • Ongekende etiologie • Bestraling • Genetische factoren: Down syndroom

11. ACUTE LYMFOBLASTISCHE LEUKEMIE • Klinisch: bloed cytopenieën (bleek, vermoeid, bloedingen, koorts, infecties), extramedullaire leukemische infiltraten (CNS, lymfadenopathie, hepatosplenomegalie) • Origine blasten: • Precursor B-lymfocyten: 85% • Precursor T-lymfocyten: 15% • Classificatie morfologisch (FAB): L1, L2, L3 (Burkitt) • Classificatie immunofenotypisch (EORTC): • Pro-B ALL, common B, pre-B, mature B • Pro-T ALL, pre-T, cortical T (common-T), mature T

12. ACUTE LYMFOBLASTISCHE LEUKEMIE Uit “Immunofenotypering in de diagnostiek: Indicatiestellingen, uitvoering en interpretatie”, Hoofdstuk 8, Adriaansen J. et al., 1994.

13. ACUTE LYMFOBLASTISCHE LEUKEMIE FAB L1, common B-ALL

14. BEHANDELINGSSTRATEGIE • Grondige evaluatie van risico op recidief: voorkomen van over- of onderbehandeling • Meeste pediatrische hemato-oncologische centra: deelname aan klinische studies waardoor behandeling volgens gestandaardiseerde onderzoeksprotocols • Geen uniform risico-classificatiesysteem • Belangrijke risico-classificatie criteria: • Initieel WBC-aantal • Leeftijd bij diagnose • Cytogenetica en ploïdie • Immunofenotype • Respons op inductietherapie

15. RISICO STRATIFICATIE

16. EORTC PROTOCOL 58951 “Dexamethasone vs prednisolone during induction and maintenance therapy, prolonged vs conventional duration of L-Asparaginase therapy during consolidation and late intensification, in ALL and NHL of childhood. A Randomised phase III.” • EORTC: European Organisation for Research and Treatment of Cancer • CLCG (EORTC Children’s Leukemia Cooperative Study Group) trial 58951: België, Frankrijk, Portugal • Vier risicogroepen: • Very low risk (VLR) • Average risk 1 (AR1) • Average risk 2 (AR2) • Very high risk (VHR)

17. VLR CRITERIA • ALL of B-cell lineage • WBC less than 10,000/mm3 • Must meet 1 of the following conditions: • DNA index greater than 1.16 and less than 1.50 and chromosome number 51-66 or unknown • DNA index not assessed and chromosome number 51-66 • DNA index greater than 1.16 and less than 1.50 and chromosome number is unknown • Good response to prephase therapy • Absence of t(9;22) or BCR/ABL, t(4;11)/MLL-AF4, or 11q23/MLL rearrangement • No acute undifferentiated leukemia (AUL) • No CNS or gonadal involvement • Precursor B-lymphoblastic NHL stage I or II

18. AR CRITERIA • Must meet 1 of the following criteria: • ALL with good response to prephase therapy who are neither VLR or very high risk (VHR) • VLR ALL with CNS involvement (CSF positive or negative) • Precursor B-lymphoblastic NHL stage III or IV without any VHR feature • Precursor T-lymphoblastic NHL • AR patients substratified in: • AR1: B-cell lineage ALL with WBC less than 100,000/mm3 • Surreptitious or hemorrhagic CSF becoming negative at D4 of prephase therapy • Precursor B-lymphoblastic NHL stage III or IV • Precursor T-lymphoblastic NHL stage I or II • AR2: B-cell lineage ALL with WBC at least 100,000/mm3 • T-cell lineage ALL regardless of the WBC • Overt or non-equivocal CNS involvement at D0 or any CSF involvement at D4 • Gonadal involvement • Precursor T-lymphoblastic NHL stage III or IV • Newborn Down syndrome patients with AR2 features are assigned to the AR1 group

19. VHR CRITERIA • Must meet 1 of the following criteria: • ALL patients meeting 1 of the following conditions: • Poor response to prephase therapy (at least 1,000/mm3 blasts in peripheral blood after completion of prephase therapy) • t(9;22) or BCR/ABL • t(4;11)/MLL-AF4 • 11q23/MLL rearrangement • Near haploidy (no more than 34 chromosomes or DNA index less than 0.7) • Hypodiploid (35-40 chromosomes or DNA index 0.7 to 0.8) • AUL • For B lineage ALL: failure to achieve complete response (CR) after completion of protocol IA • For T lineage ALL: failure to achieve CR or good partial response (GPR) after completion of protocol IA • Minimal-residual disease (greater than 1,000 blasts/100,000 mononuclear bone marrow cells) at evaluation of IA (day 35) • NHL patients who failed to achieve CR or GPR after completion of protocol IA • All VHR patients are eligible for stem cell transplantation except those whose sole VHR criterion is a poor response to prephase therapy and who have none of the following features: • T-cell immunophenotype • Early B ALL (CD10 negative) • WBC at least 100,000/mm3 • Newborn Down syndrome patients with VHR features are assigned to AR1 group

20. PLOÏDIE DISTRIBUTIE UK, 1990-1997 UZ Leuven, 1998-2005 Harrison C.J., Blood Reviews, 2001.

21. DNA-analyse onder de loep…. 1. Doen we het goed? 2. Gaan we de analyse behouden?

22. AANVRAAGFREQUENTIE

23. CYTOGENETICA • Cytogenetica: complementaire versus alternatieve methode • Karyotypering en FISH: numerische én structurele chromosomale abnormaliteiten • ALL: lage mitose-index, lage kwaliteit van de metafasen → karyotypering vaak bemoeilijkt • Doch slechts 1x geen diagnose via karyotypering op een totaal van 82 stalen (1.2%) door CME UZ Leuven • FISH tevens uitgevoerd indien geen definitieve conclusie via karyotype • Cytogenetische testen: langere antwoordtijden ( DNA-analyse: < 2 dagen) • Karyotypering: +/- 3 dagen • FISH: tot +/- 1 maand

24. KARYOTYPERING Hyperdiploïd karyotype 56, XY Philadelphia chromosoom t(9;22)

25. RETROSPECTIEVE ANALYSE: WAAROM? • Zeer lage uitvoerfrequentie: vervallen reagentia, matige expertise • Geen adequate interne controle (normaal perifeer bloed  PBMC) • Geen interne kwaliteitscontrole met kippen erytrocyt nucleï (DNA QC Particles, BD) • Geen kalibratie flowcytometer • Geen controle lineariteit • Geen controle resolutie

26. RETROSPECTIEVE ANALYSE • Resultaten DNA-analyse vergelijken met de karyotypering • Slechts 82 stalen tussen januari 1998 – maart 2005 • DNA-analyse praktisch altijd op beenmerg uitgevoerd, slechts in 2 gevallen op perifeer bloed • Karyotypering: (vermoedelijk) altijd op beenmerg

27. RESULTATEN • 68%: goede correlatie tussen DNA FCM en karyotypering • Gebrekkige correlatie in 21 gevallen (26%): altijd slechts 1-3 chromosomen afwijkend → te lage resolutie FCM • Look et al. (1985), Hiddemann et al. (1987), Perez-Vera et al. (2004) missen eveneens lage hyperdiploïdie/hoge hypodiploïdie met DNA FCM • Deze gebrekkige correlatie echter geen invloed op risico stratificatie (> 50 chromosomen: VLR, ≤ 40 chromosomen: VHR) • 5 (6%) belangrijke discordanties DNA FCM  karyotypering

28. DISCORDANTIES • 3 gevallen met meerdere leukemische lijnen (patiënt 24, 48, 49) • Leukemische lijn met laagste ploïdie arbitrair als primaire lijn • Prognostisch minst gunstige lijn bepaalt het risico • Risico diploïdie  lage hyperdiploïdie  near tetraploïdie > risico hyperdiploïdie • 1 geval (patiënt 47) met correcte analyse (DI = 1,14), echter foutief gerapporteerd • 1 geval (patiënt 46) foutief geanalyseerd als diploïd (histogram toont schouder!)

29. DNA FCM VS CYTOGENETICA • DNA-analyse na uitsluiten onoverkomelijke discordanties: 1 foutieve interpretatie op een totaal van 82 stalen (1,2%) • Karyotypering: 1x geen diagnose (1,2%), FISH toont wel vermoeden van hyperdiploïdie • Deze twee gevallen telkens toch toegewezen aan de very low risk-groep op basis van het cytogenetische respectievelijk het DNA-analyse resultaat

30. LINEARITEIT

31. LINEARITEIT Cut-off voor gunstige hyperdiploïdie: DI ≥ 1,16 of > 50 chromosomen!

32. LINEARITEIT • Look et al. (Blood, 1985) • DI ≥ 1,16 geassocieerd met ≥ 53 chromosomen • Uitzonderingen: individuele chromosomen kunnen tot 4,5-voud variëren in DNA-inhoud • Cut-off van 1,16 dient met de grootste voorzichtig-heid gehanteerd te worden • Matige lineariteit van DNA FCM in ons laboratorium voornamelijk te wijten aan slechte lineariteit flowcytometer (immers geen controle!)

33. DIAGNOSTISCHE PERFORMANTIE • DNA-index geen diagnostische maar prognostische waarde • Diagnose van very low risk-patiënten (DI ≥ 1,16 en > 50 chromosomen) • Vals negatief resultaat: DI < 1,16 en > 50 chromosomen → sensitiviteit = 17/24 = 71% • Vals positief resultaat: DI ≥ 1,16 en < 50 chromosomen → specificiteit = 54/54 = 100% • Rekening gehouden met de matige lineariteit van de flowcytometer → vals negatief resultaat in ons labo definiëren als DI ≤ 1 en > 50 chromosomen  sensitiviteit = 23/24 = 96% • Sensitiviteit/specificiteit DNA-analyse: moeilijk tot geen exacte cijfers terug te vinden in de literatuur • Enkele onderzoeksgroepen (Hiddemann et al., Perez-Vera et al.): sensitiviteit van 100% • Andere onderzoeksgroepen (Smets et al., Look et al.): near-100% retrieval van hyperdiploïdie d.m.v. DNA FCM

34. KOSTEN IMPACT • Bij elke aanvraag analyse steeds op drie verschillende celsuspensies uitgevoerd • Cellen patiënt • Cellen patiënt + normale controle • Cellen normale controle • Totaalkost/test: 32,28 € • Honoraria RIZIV voor ambulante patiënt en enkelvoudig voorschrift (B450-test): 23,23 € • Nettokost/test: 9,05 € • Prijs CycleTEST PLUS DNA reagens kit (BD; 40 testen): 233 € • Prijs DNA QC Particles kit (BD; 25 controles): 294 €

35. OVERGEBRUIK/ONDERGEBRUIK DNA-ANALYSE • UZ Leuven: enkel bij nieuwe diagnose pediatrische ALL • Andere mogelijke indicaties: • Multiple myeloma (hyperdiploïdie hier ook betere prognose) • Non-Hodgkin lymfomen (%S-fase fractie) • Vaste weefseltumoren (bijv. borsttumor: %S-fase fractie) • Andere ziekenhuizen: • UZ Gent: ALL, neuroblastoma (reagens kit Beckman Coulter) • AZ VUB: ALL (stalen worden doorgestuurd naar extern labo) • Virga Jesse Hasselt: multiple myeloma, lymfomen, weefseltumoren (reagens kit BD) • UZA: multiple myeloma (zelf-bereide reagentia) • DNA FCM en karyotypering gelijktijdig uitgevoerd om risico op vals negatieven te beperken, sequentiële strategieën echter meer kosten-efficiënt

36. Gaan we de DNA-analyse behouden of afschaffen in ons laboratorium?

37. Snelle antwoordtijd (meestal binnen 24 uur) Pediaters voor behoud: DNA FCM en karyotypering als wederzijdse controle → keuze therapieschema Sensitiviteit in ons labo slechts 71% bij cut-off DI ≥ 1,16 DI is géén vereiste voor risico stratificatie (ploïdie via karyotypering volstaat) Karyotypering en FISH superieur aan DNA FCM Analyse is verlieslatend Mogelijkheid van doorsturen naar extern labo (echter antwoordtijd  ) PRO CONTRA

38. KWALITEIT VERBETEREN? • Aliquots maken van de reagentia en bewaren op -18°C • Adequate interne controle: PBMC i.p.v. vol bloed • QC-kit of overeenkomst met BD voor (half)jaarlijkse controle en kalibratie zoals voor de overige flowcytometrische testen • Eventueel zelf-bereide reagentia i.p.v. commerciële kit (goedkoper, langere houdbaarheid) • Verhogen uitvoerfrequentie (M. Kahler, lymfomen, weefseltumoren)?

39. TO DO • Overleg met de pediaters: voor- en nadelen van de DNA-analyse goed tegen elkaar afwegen  test al dan niet afschaffen • Indien de test behouden blijft, stappen ondernemen om de kwaliteit te verbeteren (aliquots, PBMC, afspraken BD, …) • Pediaters informeren over de matige lineariteit tussen DI en # chromosomen: voorzichtigheid geboden bij hanteren van de cut-off van 1,16

40. THE END…