CROMATOGRAFÍA Y COMPONENTES DE UN SISTEMA CROMATOGRÁFICO

1. CROMATOGRAFÍA Y COMPONENTES DE UN SISTEMA CROMATOGRÁFICO Catedrática: Dra. Silvia Echeverría, Ph.D., Depto. Fisicoquímica, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, USAC.

2. FUNDAMENTOS DE SEPARACIÓN • PRINCIPIOS GENERALES • TÉCNICAS DE SEPARACIÓN • TEORÍA MECANISMOS DE SEPARACIÓN

3. Mezclas y la necesidad de métodos de separación Complejidad de las muestras: Sangre, agua de río, alimentos licuados, entre otros. Las muestras pueden contener mezclas de solutos, micelas, coloides y otras partículas en suspensión.

4. Técnicas de separación clásicas • Separación de componentes de interés Precipitación Destilación Extracción Soxhlet

5. Extracción con disolventes Extracción con ultrasonido (USE) (Líquido-líquido) Extracción en fase sólida (SPE)

6. Extracción con Líquidos presurizados (PLE) Extracción con microondas

7. CROMATOGRAFÍA • Nombre genérico asignado a muchas y distintas técnicas de separación. El nombre se debe al botánico ruso Mikhail Tsweet, quién acuñó el término a principios de la década de 1900, cuando logró separar varios pigmentos de plantas tales como xantofilas y clorofilas, al hacer pasar soluciones de esta mezcla por columnas de vidrio empacadas con carbonato de calcio finamente dividido. Cada pigmento recorrió la columna con diferente velocidad y terminó apareciendo cada componente como bandas de color. Chroma, palabra griega para color y Graphein que significa escribir.

8. CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS • Basada en la forma en que se ponen en contacto la FASE MÓVIL y laFASE ESTACIONARIA: En COLUMNA y en PLANO. • Basada en el tipo de FASE MÓVIL: CG, CL, CFS.

9. Todas las formas de cromatografía se basan en la separación de muestras de mezclas al entrar en contacto con dos fases: fase móvil y fase estacionaria. Una de las fases se mueve en relación con la otra. Los componentes de la muestra se distribuyen entre las dos fases de acuerdo con sus solubilidades (o afinidades) relativas hacia ellas. Los componentes que no interaccionan con la fase estacionaria pasan rápidamente con la fase móvil. Al revés, los componentes que si interaccionan con la fase estacionaria, se mueven con mayor lentitud.

10. Los componentes de la muestra se mueven con velocidades determinadas por los tiempos relativos que pasan en las fases móvil y estacionaria. A su vez, dichos tiempos quedan determinados por los coeficientes departición para cada componente entre las dos fases. De esta forma, se pueden separar distintos componentes debido a la velocidad relativa con que atraviesan la fase estacionaria.

11. Se puede realizar la cromatografía de elusión (con dos fases líquidas) en varias formas distintas. En muchos casos la fase estacionaria es un disolvente (por ejemplo agua) adsorbido y por consiguiente, inmovilizado en un soporte sólido, como papel de celulosa, o sílice en una columna empacada. La muestra que se va a resolver o separar en sus partes componentes se disuelve en un pequeño volumen de un segundo disolvente que tendrá el papel de fase móvil. A continuación se agrega la solución de la muestra al soporte sólido (que contiene la fase estacionaria inmovilizada).

12. A medida que la fase móvil atraviesa la fase estacionaria, los solutos se distribuyen entre las fases de acuerdo con sus coeficientes de partición respectivos. Se pueden agregar más fases móviles para ELUIR los componentes de la fase estacionaria a distintas velocidades. (Puede imaginarse este tipo de cromatografía como una serie continua de extracciones líquido-líquido). Al final todos los componentes serán eluidos del sistema del que se trate y así la mezcla quedará separada.

13. TEORÍA DE LAS SEPARACIONES CROMATOGRÁFICAS Coeficientes de partición Todas las separaciones cromatográficas están gobernadas por coeficientes de partición KD de solutos, entre las fases estacionaria y móvil. Para un soluto S se establece un equilibrio dinámico, esto es: S móvil S estacionario

14. El coeficiente de partición o de distribución, KD, es igual a la relación de la concentración del soluto en las dos fases, tal como en la ecuación: KD = [S]est/[S]móv (croma 01) Donde KD es el coeficiente de partición y [S]est y [S]móv son las concentraciones molares del soluto S en las fases estacionaria y móvil respectivamente. En el caso ideal, el valor de KD debe permanecer constante dentro de un amplio margen de concentraciones de soluto, para asegurar que la relación misma de [S] est y [S] móv quede constante. Se puede suponer que la cromatografía efectuada bajoestas condiciones tiene comportamiento lineal, lo cuál permite hacer determinaciones cuantitativas a partir del cromatograma.

15. En la práctica, bajo la mayor parte de condiciones normales de trabajo, se puede suponer que KD esconstante, aunque a concentraciones muy altas la fase estacionaria puede volverse parcial o totalmentesaturada.

16. TIEMPO DE RETENCIÓN TIEMPO DE RETENCIÓN En esta figura se observa un cromatograma característico para una muestra que contiene un solo analito. El tiempo que transcurre luego de la inyección de la muestra hasta que se alcanza la concentración máxima del analito en el detector, se denomina Tiempo de Retención (tR)

17. El tiempo que tarda un analito en eluirse de una columna, también se llama tiempo de retención o tiempo de residencia. Si un soluto en la fase móvil no interacciona en absoluto con la fase estacionaria, se moverá con la misma velocidad que la fase móvil, dicho tiempo se puede representar como tmóv y también se le denomina, en algunas ocasiones, tiempo muerto (tM). Si el analito pasa una parte del tiempo en la fM y otra parte en la fE, su velocidad de avance estará determinada por el coeficiente de partición KD y en consecuencia, distintos analitos serán eluidos de la columna en tiempos distintos que dependen de sus coeficientes de partición dentro de la columna.

18. La velocidad lineal promedio del movimiento, u, de la fasemóvil, se puede expresar de acuerdo a la ecuación: u = L/tmóv (croma 02) En donde L es la longitud de la columna. En forma similar, para cualquier pico cromatográfico, se puede expresar la velocidad lineal promedio de migración del soluto por medio de la ecuación: ṽ = L/tR (croma 03) El tiempo de retención tR de un soluto se puede relacionar con su coeficiente de partición KD expresando la velocidad de migración del soluto ṽ en función de una fracción de la velocidad de la fase móvil, tal como en la ecuación:

19. ṽ = u * (fracción del tiempo en la fase móvil) (croma 04) Sin embargo, se deben tomar en cuenta los volúmenes de las fases estacionaria y móvil, a los cuáles se les llama Vest y Vmóv respectivamente. Basados en lo anterior, la velocidad de migración delsoluto para determinado pico cromatográfico, se puede expresar así: ṽ = u * (1)/(1+KD Vest/Vmóv) (croma 05)

20. EL FACTOR DE CAPACIDAD Es un parámetro para comparar las velocidades relativas de migración de soluto en las columnas. Dicho factor k’ se puede calcular con la ecuación: k’ = (tR – tmóv)/tmóv (croma 06) En el caso ideal, k’ debe estar dentro del intervalo de 1 a 5. Si k’ es mucho menor que 1, la elución será tan rápida que será difícil determinar con exactitud los tiempos de retención. Por lo contrario, si el factor capacidad es mucho mayor que 20, los tiempos de retención serán excesivos.

21. Ejemplo para calcular k’: Si el tiempo de retención tR de un pico cromatográfico es 65 y tmóv es 30s, calcular k’, el factor de capacidad. Método: Calcular k’ de acuerdo con la ecuación: k’= (tR – tmóv)/tmóv k’ = 65 – 30/30 = 1.17 s-¹ EL FACTOR DE SELECTIVIDAD , parados solutos A y B, se define como  = K’B/K’A (croma 07) donde KB es el coeficiente de distribución para la especie más fuertemente retenida y KA es el factor de distribución para la menos retenida.

22. De acuerdo con esta definición,  siempre será mayor que la unidad. Sustituyendo una de las ecuaciones anteriores y la análoga para la especie B en la última ecuación, se obtiene, después de reordenar, una relación entre el factor de selectividad para dos analitos y sus factores de retención:  = k’B/´k’A (croma 08) Donde k’B y k’A son los factores de retención de A y de B respectivamente. La sustitución en la ecuación croma 06, para las dos especies en la ecuación croma 07 da otra ecuación que permite la determinación de  a partir de un cromatograma experimental:

23. = [(tR)B – tmóv]/[(tR)A – tmóv] (croma 09) EFICIENCIA de las COLUMNAS CROMATOGRÁFICAS Se puede describir la eficiencia de una columna ya sea en función de El número de platos teóricos N, o de la Altura de plato H (HETP). Ambas acepciones se relacionan con la ecuación de VanDeemeter, en honor del primer científico que describió teóricamente una ecuación para cuantificar la eficiencia de las columnas cromatográficas.

24. Ecuación de Van Deemeter: H = L/N H es HETP L es longitud de la columna

25. La terminología de platos teóricos y altura de plato para describir la eficiencia de las columnas usadas en cromatografía es un legado histórico de un modelo teórico de cromatografía que ya se ha superado en gran parte. El uso del término “Plato teórico” no debe concebirse como una representación física de la columna ni de su operación, más bien es un parámetro arbitrario para describir su eficiencia. La eficiencia de la columna mejora a medida que: a) Aumenta el número de platos y b) Se reduce la altura de plato. El número de platos teóricos puede variar desde algunos cientos hasta varios cientos de miles, mientras que la altura de plato puede variar desde algunos milímetros hasta algunas decenas de micras.

26. Se ha observado que un pico cromatográfico se ensancha a medida que aumenta su tiempo de retención Asimismo el tiempo de retención de un pico aumentará si se incrementa la longitud de la columna. Entonces, a medida que la longitud de la columna aumenta, los picos cromatográficos se ensanchan. Ya que el pico tiene la forma de una curva de distribución de Gauss, se puede expresar esa forma en función del ancho que abarca más o menos una desviación estándar σ. Entonces se puede expresar la desviación estándar en función de la varianza, σ² H = σ² /L (croma 10) Notar que las unidades de L son cm, las de σ² soncm², debido a lo cuál H también tiene cm como unidades y se puede concebir como relacionada con la longitud de

28. la columna que contiene a (L – σ) proporción del analito. También se puede obtener el número de platos teóricos en forma directa, a partir de un cromatograma, ya que se puede demostrar que: N= 16(tR/w)² (croma 11) Donde tR es el tiempo de retención y w es el ancho de la base del pico cromatográfico. Tal como se ha observado, el tiempo de retención de un soluto, se relaciona con la longitud de la columna. En la práctica es más fácil medir tiempos de retención en forma directa en cromatogramas y usarlos para expresar la eficiencia de la columna.

29. EJEMPLO PARA CALCULAR LA ALTURA DE PLATO TEÓRICO HETP: Un pico cromatográfico tiene un tiempo de retención de 52 s. El ancho de la base del pico equivale a 3.2 s, en la intersección de los lados de pico con la línea base. Si la columna tiene 500 cm de longitud, calcular la HETP en centímetros por plato. Procedimiento: Calcular N con la ecuación N =16(tR/w)² y luego calcular HETP con la ecuación HETP = L/N N = 16 (52/3.2)² = 16 (16.25)² = 4225 Por lo que: HETP = 50/4225 = 0.012 cm por plato

30. FORMAS DE LOS PICOS CROMATOGRÁFICOS En esta figura se observan los perfiles de concentración de los analitos A y B en dos tiempos distintos en su migración a lo largo de la columna.

31. Se puede apreciar que en el caso típico, los picos tienen la forma de una curva de Gauss de distribución normal. Las formas de dichos picos se pueden atribuir al movimiento aleatorio de las partículas de soluto, a medida que la solución atraviesa la columna. Habrá un tiempo de retención que corresponda a la cantidad máxima de moléculas de soluto que eluyen de la columna. Las moléculas de soluto sufren muchos miles de transferencias entre las fases móvil y estacionaria por las que atraviesan dentro de la columna; sin embargo el tiempo que tarda una molécula en cada fase es aleatorio e impredecible. El soluto sólo se puede mover mientras está en la fase móvil y así se concluye que si la molécula de soluto pasa más tiempo en la fase estacionaria, recorre la columna con más lentitud y por lo tanto,

32. Si la molécula pasa mayor proporción de tiempo en la fase móvil, recorrerá la columna más rápidamente. El intercambio de un soluto entre una y otra fase requiere gasto de energía y como en cualquier sistema en el que sucede una transferencia de energía, el proceso es de naturaleza aleatoria. El resultado de estos intercambios aleatorios entre las dos fases produce el ensanchamiento de los picos cromatográficos. El ancho de un pico se relaciona con el tiempo promedio que tarda un soluto en eluirse de la columna, o sea, con su tiempo de retención. Los picos cromatográficos con mayor tiempo de retención también son los más anchos.

33. ENSANCHAMIENTO DE BANDA O DE PICO