Kromatiini remodelleerimine

1. Kromatiini remodelleerimine Kromatiini remodelleerimise all mõistetakse nukleosoomide liigutamist DNA-l. Nukleosoomide liigutamine on vajalik kõikide DNA-ga seotud protsesside toimumiseks, sest aeg-ajalt on vaja tagada ligipääs nendele DNA lõikudele, mis muidu on nukleosoomidega “kaetud” või siis sulgeda juurdepääs nendele lõikudele, mis muidu jääksid nukleosoomist välja. Kromatiini remodelleerivad faktorid on olulised geenide aktivatsioonil ja repressioonil, DNA replikatsioonil ja reparatsioonil ning muudel DNA-ga toimuvatel protsessidel. Suur osa kromatiini remodelleerivaid faktoreid sisaldab bromo- või kromodomääni, seega on nende afiinsus suurem selliste nukleosoomide suhtes, kus on juba toimunud atsetüleerimine või metüleerimine. Reeglina tuuaksegi kromatiini remodelleerijad kohale peale seda kui histoonide atsetüül- või metüültransferaasid on oma töö teinud. Kromatiini remodelleerivate valgukomplekside tööks on vajalik ATP energia.

2. Kromatiini remodelleerivad valgukompleksid • Kromatiini remodelleerivaid komplekse jaotatakse vastavalt nende aktiivsusele, koostisele ja funktsioonile viieks erinevaks rühmaks, kuid neile kõigile on omane kõrgelt konserveerunud ATPaasi domään. • SWI/SNF perekonna valgud. See grupp on nimetatud esimesena avastatud kromatiini remodelleeriva valgukompleksi SWI/SNF järgi (leiti pärmist kui otsiti transkriptsiooni mõjutavaid geene; SNF = ‘sugar non-fermenting’), hiljem leiti selle homolooge otsides pärmist ka RSC (remodels the structure of chromatin) kompleks. Järgnesid homoloogide leidmised inimesest (hSNF/SWI) ja Drosophilast (Brahma). Kõik need kompleksid sisaldavad ka bromodomääne (näiteks RSC kompleksis on neid kokku koguni 8). • ISWI perekonna valgud. Esimesena leiti ISWI (imitation switch) Drosophilast, hiljem lisandusid ACF (ATP-utilizing chromatin assemblyand remodeling factor), NURF (nucleosome remodeling factor) ja CHRAC(chromatin accessibility complex). Neis kõigis on üks ja sama ATPaas (ISWI), komplekside erinevus seisneb selles, et milliste teiste valkudega ISWI parasjagu seondunud on. Nendel kompleksidel on SANT-domään.

3. Kromatiini remodelleerivad valgukompleksid 3. INO80 perekond.INO80 identifitseeriti algselt pärmis, hiljem leiti seda ka Arabidopsis’est ja inimesest. INO80 on oluline DNA reparatsioonil nukleosoomide eemaldamiseks kahjustatud DNA piirkonnast. 4. Mi-2/NURD perekond. Mi-2/NURD(nucleosome remodeling and deacetylation) leiti esmalt inimese rakkudest, hiljem ka pärmist, Drosophilast ja Xenopus’est. Need kompleksid omavad nii kromatiini remodelleerivat kui ka histoone deatsetüleerivat aktiivsust. 5.SWR1 kompleks. Seda on leitud inimesest, pärmist, ja Drosophilast. Selle kompleksi eripäraks on alternatiivse histooni H2A.Z lülitamine nukleosoomide koosseisu.

4. Millistes bioloogilistes protsessides kromatiini remodelleerijad osalevad?

5. Kromatiini remodelleerivad valgukompleksid Kõige põhjalikumalt on uuritud SWI/SNF ja ISWI tüüpi kromatiini remodelleerivaid komplekse. Enamasti täidavad need vastandlikke ülesandeid: SWI/SNF osaleb peamiselt geenide aktivatsioonil, ISWI aga repressioonil. ISWI tekitab korrapärast nukleosoomide struktuuri (lükkab nukleosoomid üksteise kõrvale ühtlaste vahedega kokku), SWI/SNF aga ajab nukleosoome laiali, vabastades sellega DNA-d juurdepääsuks teistele faktoritele. ISWI on oluline DNA replikatsiooni käigus uute nukleosoomide moodustamisel ja eriti nende korrapärase paiknemise kujundamisel, SWI/SNF sellist aktiivsust ei oma.

6. Kuidas nad töötavad? Katsed mononukleosoomidega näitasid, et ISWI lükkab nukleosoomid kas DNA lõigu keskele või siis täpselt otsani. Kumb täpselt juhtub, sõltub sellest, millise konkreetse ISWI kompleksiga on tegu. SWI/SNF jõuab valdavalt selleni, et nukleosoom on lükatud ligikaudu 50 aluspaari jagu üle DNA otsa maha, või kui seda ei juhtu, siis jääb nukleosoom DNA-l suvalisse positsiooni. SWI/SNF on ka võimeline “tõstma” histooni oktameeri ühelt DNA molekulilt teisele.

7. Kuidas nad töötavad?

8. SWR1 kompleks ja histooni variant H2A.Z SWR1 kompleks on eriline selle tõttu, et tema põhiliseks (kui mitte ainsaks) oluliseks funktsiooniks on histooni variandi H2A.Z (pärmis Htz1) lülitamine kromatiini. Näiteks pärmis viib HTZ1 ja SWR1 geenide inaktiveerimine peaaegu identsete fenotüüpideni ning mõlema geeni üheaegne deleteerimine ei oma mingit lisafenotüüpi võrreldes ühe geeni deletsiooniga. SWR1 inaktiveerimise tulemusena peatub ka Htz1 lülitamine nukleosoomidesse. Pärmi SWR1 kompleksi biokeemilisel puhastamisel leiti, et see koosneb kokku 12-st subühikust, millest üks on Htz1. H2A.Z on histooni H2A variant, mis on evolutsiooniliselt konserveerunud. H2A.Z on 60% ulatuses identne H2A-ga, suuremad erinevused asuvad valkude C-terminustes. H2A.Z moodustab dimeeri histooniga H2B ning selline dimeer võib nukleosoomides asendada “normaalset” H2A-H2B dimeeri. Htz1 histooni leidub kõige rohkem pärmi geenide promootorpiirkondades ja sub-telomeersetel aladel ning HTZ1 geeni deleteerimine pärmis põhjustab häireid umbes 200 geeni transkriptsioonis.

9. H2A.Z lokalisatsioon kromosoomil

10. SWR1 kompleks ja histooni variant H2A.Z SWR1 suudab nii in vitro kui in vivo katsetes vahetada nukleosoomis oleva H2A-H2B dimeeri H2A.Z-H2B dimeeri vastu ning selleks protsessiks on vaja ATP energiat. SWR1 kompleksi kuulub ka kahte bromodomääni sisaldav valk Bdf1, mis seostub atsetüleeritud histoonidega, eriti H4-ga. Samuti on osa SWR1 kompleksi valkudest identsed NuA4 HAT kompleksiga, mistõttu transkriptsiooni aktivaatorid, mis toovad geenide promootoritele NuA4, võivad kohale tuua ka SWR1 kompleksi. Kokkuvõtteks juhtub nii, et SWR1 jõuab kas aktiivselt või passiivselt geenide promootoraladele, kus ta vahetab nukleosoomis oleva H2A-H2B dimeeri välja H2A.Z-H2B dimeeri vastu. Arvatavasti algab H2A.Z lülitamine nukleosoomi sama mehhanismiga, mida kasutavad ka teised kromatiini remodelleerivad faktorid: DNA-d hakatakse nukleosoomile peale “pumpama”, kuid lahtise DNA laine peatatakse kui see on jõudnud H2A-H2B dimeeri piirkonda, H2A-H2B eemaldatakse ning pannakse asemele H2A.Z-H2B.

11. SWR1 kompleks ja histooni variant H2A.Z See on esialgu siiski vaid hüpotees, täpne mehhanism pole teada, ega ka mitte see, mis saab “vanast” H2B-st. Kas vahetatakse välja kogu dimeer, või ainult H2A? Teada on, et kui vahetamiseks juba läheb, siis vahetatakse välja mõlemad H2A valgud – sellist nukleosoomi, milles oleksid samaaegselt olemas nii H2A kui H2A.Z, pole leitud. Samas pole teada, kas mõlemad H2A-d vahetatakse välja korraga või ükshaaval. Samuti pole leitud ensüümi, mis teeks vastupidist reaktsiooni: vahetaks H2A.Z välja H2A vastu. Siin võib olla seos epigeneetilse mäluga. Mis siis nendes H2A.Z nukleosoomides teisiti on? 1. H2A.Z võib olla seondumiskohaks erinevatele rakulistele faktoritele, näiteks neile, mis on olulised transkriptsioonil. Samuti on H2A.Z post-translatsioonilised modifikatsioonid veidi erinevad sellest, mis on H2A-l. 2. Erinevused H2A ja H2A.Z vahel mõjutavad veidi ka nukleosoomi üldist struktuuri. Esialgu on saadud vastuolulisi andmeid, kas need erinevused stabiliseerivad või destabiliseerivad nukleosoomi. Aga igal juhul on see üks võimalus, kuidas promootoritel olevad nukleosoomid teistest erinevateks teha.

12. Teised histoonide variandid Lisaks H2A.Z-le eksisteerib veel mitmeid teisigi histoonide variante. On olemas alternatiive histoonidele H3 ja H2A, kuid mitte histoonidele H4 ja H2B.

13. Teised histoonide variandid Imetajate rakkudes toimub pidevalt histooni H2AX süntees ning umbes 10% nukleosoomidest sisaldab seda histooni. DNA katkete korral toimub kiirelt H2AX C-terminuse fosforüleerimine ning see on väga oluline signaal DNA reparatsiooni käivitamiseks. Ka histooni H3.3 süntees toimub kogu rakutsükli vältel ning see on H3 variant, mida lülitatakse kromatiini muul ajal kui DNA replikatsioonis. Kuna H3 võib DNA-lt eemalduda ka transkriptsiooni käigus, siis kokkuvõtteks leidub H3.3 põhiliselt transkriptsiooniliselt aktiivses kromatiinis. Pärmi “normaalne” H3 on tegelikult sama, mis imetajate H3.3 ning pärmi “normaalne” H2A on sama, mis imetajate H2AX. CENPA on spetsiifiliselt tsentromeeri piirkonnas olev H3 variant ning see sisaldab endas tsentromeeri lokaliseerimise domääni (centromere targeting domain). Kui see domään kleepida tavalise H3 külge, siis lülitub see ka tsentromeeri piirkonda.

14. Miks “erilised” histoonid replikatsiooni käigus kaotsi ei lähe? Hüpotees: Kuna ühe ringi replikatsiooni käigus toimub signaali “lahjenemine” 50%, siis allesjäänud 50% on piisav, et mõistliku aja jooksul (enne järgmist replikatsiooni) algne olek taastada.

15. Heterokromatiin Läbi aegade on kromatiini jaotatud laias plaanid kaheks: Eukromatiin ja Heterokromatiin. Eukromatiin on see osa kromatiinist, mis on valdavalt dekondenseerunud olekus ning seal toimub geenide transkriptsioon. Seda osa kromatiinist iseloomustab histoonide kõrge atsetüleerituse tase ning samuti transkriptsiooniliselt aktiivsele kromatiinile omased histoonide metüleerimised (H3 K4, K36 K79) Heterokromatiin on tihedalt kokku pakitud kogu rakutsükli vältel ning selles kromatiini piirkonnas transkriptsiooni ei toimu. Ka DNA rekombinatsioon toimub heterokromatiinis märksa harvemini kui eukromatiinis. Heterokromatiini iseloomustavad deatsetüleeritud histoonid ja metüleerimised positsioonides K9 ja K27 histoonil H3 ning K20 histoonil H4. Heterokromatiini jaotatakse omakorda konstitutiivseks ja fakultatiivseks heterokromatiiniks. Need piirkonnad erinevad ka histoonide metüleerimiste mustrite poolest: Konstitutiivne: tri-meK9; mono-meK27; tri-meK20 Fakultatiivne: di-meK9; tri-meK27; mono-meK20

16. Sir3 Sir4 Sir2 Rap1 Heterokromatiin Heterokromatiin on oluline mitmetes kohtades ja olukordades. Lisaks telomeeridele (kus tuleb kaitsta kromosoomide otsi), on heterokromatiin ka tsentromeeri piirkonnas, seda on vaja imetajates ühe X-kromosoomi transkriptsiooniliseks inaktiveerimiseks, samuti on sellel roll igasuguse võõr-DNA vaigistamisel. Algselt töötas see ainult looduslike parasiitsete DNA-de vastu, praegu käib võitlus ka optimistlike geenitehnoloogide vastu, kes püüavad geeniteraapia käigus võõr-DNA-d genoomi viia. Heterokromatiini iseloomustab ka võime levida: kui see on juba korra tekitatud, siis hakkab toimuma ahelreakstioon, mis viib üha suurema osa kromatiini heterokromatiniseerumisele. Rakud peavad spetsiaalselt vaeva nägema, et sellist levikut tõkestada.

17. Heterokromatiin Teistes eükarüootides (peale S. cerevisiae) on heterokromatiini moodustumiseks vajalik HP1 valk, mis seondub spetsiifiliselt H3 meK9 modifikatsiooniga. Kromatiinile seondunud HP1 aga toob kohale histooni metüül-transferaasi (näiteks Drosophilas SU(VAR)3-9), mis metüleerib K9 naabernukleosoomis. Ja siis see tükkel kordub. Mõnedel juhtudel aitavad siRNA-d (small interfering RNA) indutseerida heterokromatiini tekke spetsiifilistes lookustes. Näiteks RITS kompleks (RNA-induced transcriptional gene silencing) on oluline tsentromeeride heterokromatiniseerumiseks S.pombe’s. RITS sisaldab HP1 ja ka siRNA-d, mis vastab tsentromeeri kordusjärjestustele ning annab kompleksile kromatiinile seondumise spetsiifika.

18. Heterokromatiin Heterokromatiini leviku takistamiseks tuleb midagi teha. Enamsti piiratakse heterokromatiini levikut mingi tõkestava DNA järjestusega (boundary element), mis sageli on mõni eriti tugevalt transkribeeritav ala (näiteks mõni tRNA geen). Sellistele tugevalt transkribeeritud aladele on tavaliselt kohale toodud mõni kromatiini modifitseeriv ensüüm, mis töötab otseselt heterokromatiini tekkeks vajalike modifikatsioonide vastu. Näiteks H3 K9 või H4 K16 spetsiifiline HAT.