Gene expression microarray

1. Gene expression microarray Halaška,M., Chod,J., Strnad,P., Kolařík,D., Hrouda,M. Gynekologicko-porodnická klinika FN Motol a 2. LF UK Gynekologicko-porodnická klinika FN Bulovka a 1. LF UK

2. Úvod • známa sekvence lidského genomu: 30 000-40 000 genů • metodika analýzy microarray vyvinuta na Stanfordu (Schena,M., Science, 270, 1995) • na 65 vzorcích testováno 8102 genů (Perou CM, Nature, 2000) • clinical implications (Sorlie, T, 2001)

3. Rozdělení • podle typu sondy • cDNA • k analýze genomu (sekvenční analýza, variabilita genu) • k analýze genové exprese (RNA) • proteinové • tkáňové (TMAs) • podle přípravy • oligonukleotidy (20-100 bp) pomocí fotolithografie • cDNA (300-4000 bp) předem připravené na čipu PCR

4. Hybridizace dvouřetězcová DNA DENATURACE RENATURACE jednořetězcová DNA

5. Hybridizace • spojení 2 jednořetězcových molekul (DNA nebo RNA) různého původu DENATURACE RENATURACE

6. Hybridizace DENATURACE RENATURACE

7. Postup • izolace mRNA z tkáně • reverzní transkripcí do DNA - následně namnožení • označení červenou flurescencí • smíchání se zelenými referenčními geny • scanování a vyhodnocení převahy

8. jedno políčko mikročipu = hybridizační jednotka SONDA cDNA sklo se spec. upraveným povrchem nebo nylonová membrána nanesení: ink jet technology photolitography

9. DNA RNA mRNA cDNA cRNA NK označená fluorescenční barvou Hybridizace

10. Hybridizace

11. Promytí čipu

12. Promytí čipu

13. Laserové světlo Ozáření světlem urč. vlnové délky

14. DETEKTOR FLUORESCENCE

15. DETEKTOR Měření intenzity fluorescence = odpovídá množství RNA ve vzorku FLUORESCENCE

18. Microarrays po hybridizaci - počítačové zobrazení Affymetrix - genové čipy cDNA microarray

19. Hodnocení • kontrolované (supervised) • nejdříve stanovení genové exprese • vytvoření skupin podle podobnosti exprese • vytvoření dendrogramu • poté hledání klinického významu skupin • nekontrolované (unsupervised) • nejčastěji hierarchial clustering • rozdělení vzorků do skupin podle vlastností • stanovení exprese • hledání genů, které jsou odlišné v jednotlivých skupinách

21. Analýza velkého počtu genů 30 000 vytypování omezeného počtu genů s výpovědní hodnotou (charakterizující profil exprese) (70) Extrémní finanční nároky 1 čip - 1000 USD desítky vzorků

22. Analýza velkého počtu genů 30 000 vytypování omezeného počtu genů s výpovědní hodnotou (charakterizující profil exprese) (70) Extrémní finanční nároky 1 čip - 1000 USD desítky vzorků Levnější metody kvantitativní RT-PCR miniarrays - čip s omezeným počtem sond

23. Analýza velkého počtu genů 30 000 vytypování omezeného počtu genů s výpovědní hodnotou (charakterizující profil exprese) (70) Extrémní finanční nároky 1 čip - 1000 USD desítky vzorků Levnější metody kvantitativní RT-PCR miniarrays - čip s omezeným počtem sond Budoucnost: kombinace výsledků do jednoho superčipu - staging, grading, prognóza, rezistence...

24. Perou,CM., Nature, 2000 • soubor 65 vzorků. 8102 genů, z toho 36 duktálních IBC, 2 lobulárních IBC, 1 DCIS, 1 fibroadenom, 3 normální vzorky • u 20 pacientů byla podána chemoterapie, 2 nádory porovnány s SLN • referenční cDNA z 11 linií, provedeno hierarchial clustering • vytipováno 1753 genů, alespoň 4x variabilnější než medián ostatních • nalezena výrazná heterogenita mezi nádory • sety genů byly navzájem nezávislé • 15 z 20 vzorků před a po chemoterapii byly velmi podobné (clustred together), stejně jako 2 vzorky metastáz • byla určena skupina genů – intrinsic gene set – která představovala skupinu výrazně proměnlivých genů mezi jednotlivými nádory • vyselektováno 496 genů, pomocí kterých rozdělení na 4 skupiny podle fenotypu: basal-like, luminal-like, ERBB2, normální

25. gene exp. name ER prognoza BRCA p53 (%) luminal like A ++ dobrá BRCA 2 13 luminal like B + 40 luminal like C + 80 basal like - špatná BRCA 1 82 ERBB2+ - špatná 71 normální 33 Sorlie,T., PNAS, 2001 • soubor 78 vzorků, 51 vzorků bylo od pacientů po chemoterapii – doxorubicin, následován tamoxifenem, u 2 tumorů testovány rovněž metastázy z lymfatických uzlin • 427 intrinsic genů na základě předchozí práce • byly nalezeno 6 typů genetických profilů:

26. Sorlie,T., PNAS, 2001 (cont.) • hodnocení p53: exprese p53 je nezávislá na ERBB2 vytipováno 158 genů v souvislosti s p53 • sledována survival analysis, vyselektováno 264 survival genů: 71 z 78 nádorů se z hlediska přežití rozdělilo na stejné skupiny jako podle charakteristik (viz výše) • zdá se, že skupina luminal like B nebude profitovat z adjuvantní antihormonální léčby (charakteristiky jsou podobné basal like, ERBB2)

27. van´t Veer, PNAS, 2003 • 117 tumorů (z toho 20 familiárních tu) u mladých žen • rozlišeno luminal like A, luminal like B, basal like, ERBB2 • Kaplan-Meier analysis • rozdíly mezi luminal A a B nebyly tak zřetelné • 18 BRCA 1 a 2 BRCA 2 • BRCA 1 nalezeno výhradně v souvislosti s basal like (zároveň vysoká exprese p53, ER negativní, ERBB2 negativní)

28. You,F., San Antonio, 2004, 1022: pomocí gene expression na 21 vzorcích byla stanovena skupina genů, které by mohly předvídat odpověď na Herceptine/Vinorelbine chemoterapii u HER 2 3+ early breast cancer • Liu,MC., San Antonio, 2004, 1030: gene expression u linie MDA MB 231 sériově po aplikaci docetaxelu 0-14 dní, identifikován set 122 genů, který s přesností 89 % diskriminoval mezi respondenty a nonrespondenty • Rouzier,R., San Antonio, 2004, 201: FNA u 83 pacientů před neoadjuvantní chemoterapií, použití intrinsic gene set podle Perou, chemoterapie: paclitaxel, 5-FU, doxorubicin, cyklofosfamid, basal-like nejlépe zareagovaly na chemoterapii (cPR), luminal-like nejméně • Miller,WR., San Antonio, 2004, 1020: u 69 pacientů provedeny 3 biopsie během neoadjuvantního podávání letrozolu, vytipování genů a sledování jejich exprese, které souvisí se vznikem rezistence na terapii geny: trefoil, LIV-1, PgR, cyclin B2, BRCA 1 a další • Harris,C., San Antonio, 2004, 3007: vytipování 16 genů, které s přesností 89 % mohou předpovídat riziko rekurence nádoru San Antonio 2004: 87 prezentací

29. Využití • staging, grading, vyhledávání podskupin • therapy tailoring (individualizace léčby) • indikace adjuvantní/neoadjuvantní terapie • pochopení metastazování • genový profil metastáz je velmi podobný primárnímu nádoru (neplatí teorie o selekci) • vytipování genů s významným efektem - cíl terapie

30. Projekt Chemosense • grant EU: Use of in-vitro chemosensitivity testing and gene expression profiling to optimize neo-adjuvant breast cancer treatment (Univ. Prof. Dr. Ch. Singer) • cílem: • vyhodnotit možnosti in-vitro testování chemosenzitivity pomocí ATP-TCA u pacientek podstupující neoadjuvantní chemoterapii Epirubicin, Docetaxel • nalezení typické genové exprese, která by předvídala senzitivitu k této chemoterapii • rozšíření testování na další zhoubné nádory (ca ovaria).