Medicago arborea Medicago citrina

1. Relationships of the Woody Medicago Species (Section Dendrotelis) Assessed byMolecular Cytogenetic AnalysesTugasPresentasioleh : YacobusSunaryo Medicagoarborea Medicagocitrina

2. INTRODUCTION Medicagoadalah genus darifamililegume (Fabaceae) yang termasukspesiespentingsecaraekonomidanpertanian (yaituM. sativa, alfalfa) dan model organismeuntukbiologi legume (M. truncatula). Berlainandenganmedicago yang lain, yang merupakansemak/herbal semusim/annual atautahunan/perennial, golonganDendrotelismeliputi herbal/semakberkayu yang dapatmencapaitinggi 4 m, denganbatang perennial (keras) yang memilkilingkartahunbatangdankulit yang dibentukolehkambium (Small and Jomphe, 1989). TigadiantaranyaadalahM. arborea, M. citrinadanM. strasseri. Tiga medics berkayutersebutadalahpolyploid, M. arboreadanM. strasseriadalahtetraploid (2n=32; Falistocco (1987) danGonza´lez-Andre´s (1999), danM. citrinahexaploid (2n = 48; Boscaiu et al., 1997).

3. BEBERAPA CONTOH TAMPILAN TANAMAN MEDICAGO Medicagotruncatula Medicagoarborea Medicagocitrina Medicago sativa, alfafa

4. AIMS OF THE STUDY Kajianinidimaksudkanuntukmengevaluasi: (a) susunanmolekulercitogenetikdari ribosomal loci (45S dan 5S) (b) hubungangenomikantaramedicagogolonganDentrotelismelaluiteknik in situ hibridisasi (FISH: Fluorescence in Situ Hybrizationdan GISH: Genomic in Situ Hybrization). Pendekatantersebutmemilikipotensiuntukberperan: mengevaluasihubungantaksonomidarispesiesDentrotelis mendapatkejelasanterhadapasal auto atauallopoliploiddarihexaploidM. citrina, mengevaluasitingkatvariasiinfraspesifik yang berhubungandengan ribosomal loci padaspesies insular tertentu (M. citrina)

5. MATERIALS AND METTHODS Plant material M. arborea, M. citrinadan M. strasseridiperolehdaripopulasidilapanganataudarikebunbotani (Tabel 1). Spesies yang lain darigolonganMedicago, M. marina, yang secarafilogenetikdekatdengananggotagolonganDendrotelis(Downie et al., 1998; Juan, 2002), digunakansebagaipembanding.

6. Tabel 1. Spesiesdanasalbahan yang digunakandalampenelitianinidanjumlah chromosome daribahan yang dianalisa

7. Biji-bijidikecambahkanpada agar 0,6% didalam Petridis padasuhu 20oC Pucukakar yang sedangtumbuhaktifdipisahkandaribibit (dipotong) dandiperlakukanpendahuluandengan 0,002 M 8- hydroxyquinolineselama 2 jam padasuhu 20-25oC dankemudianselama 2 jam padasuhu 4oC CHROMOSOME PREPARATION Pucukakardimasukkandalamcampuranetanol : asamasetat (3 :1) dandisimpanpadasuhu 20oC sampaidigunakan Pucukakardicucidalam 10 mM citrate buffer, pH 4,6, dankemudiandigerusdalamcampuran 2% (v/v) selolosa (Calbiochem) dalam citrate buffer, pH 4,6, dan 20 % pectinase (berasaldariAspergilusniger) dalam 40% gliseroldalam 10 mM citrate buffer, pH 4,6, selama 1 jam padasuhu 37oC. (ProsedurkeseluruhandibuatberdasarkanZhong et al. (1996) untukmempersiapkannukleatdan chromosome pada in situ hibridisasi Slide diwarnaidenganlarutan 4 % Giemsa yang dilarutkandengan 0,2 M So¨rensen phosphate buffer, pH 6.9.

8. DuafamilimultigendarirDNAdilokalisirdengandua DNA probes yang berbeda. Klon pTa71 adalahpotongan 9-kb EcoRI yang mengandung 18S–5,8S–26S rDNA gen dandaerahintergenic spacer dariTriticumaestivum (Gerlach and Bedbrook, 1979) DNA PROBES AND LABELLING FOR FISH 5S rDNAdilokalisirmenggunakanklon pTa794, yang mengandung 410-bp BamHIpotongandari gen 5S rDNAdanintergenic spacer dariT. aestivum (Gerlach and Dyer, 1980) Potongan 5S rDNAdiamplifikasidengan primer universal M13 bolakbalik. Hasil PCR dimurnikanmenggunakanperangkat filter (Millipore) Montage PCR Centrifugal. Probe pTa71 dan pTa794 dilabelibaikdengan digoxigenin-11dUTP maupun biotin-11-dUTP dengantranslasipemotonganberdasarkanprotokolpabrik (Roche, Germany)

9. ProtokoldilakukanberdasarkanChiavarino et al. (2000) dengansedikitmodifikasi. Chromosome yang telahdisiapkandisimpanpadasuhu 37oC selamasatumalam yang diikubasidalamRNase A (1 µg mL–1) dalam 2x SSC selama 1 jam padasuhu 37oC. Selanjutnya slide dicucitiga kali selama 5 menitdalam 2xSSC, masukkandalam 4% paraformaldehidedalam 1xSSC selama 10 menitpada temperature kamar, dicucitiga kali selama 5 menitdalam 2xSSC, kemudiandidehidrasidalametanoldanudarakeringsecaraberurutan. Sebelumhibridisasi, chromosome yang telahdisiapkandidenaturisasidalam 7%(v/v) formamidedalam 2xSSC padasuhu 68oC selama 2 menit, dehidrasimelaluiserangkaianetanoldingin-membekudanudarakering FISH Campuranhibridisasi, mengandung 2 µg mL21 darisetiap probe berlabel (45S rDNA and 5S rDNA) didenaturisasidenganpendidihanselama 10 menit, ditaruhdiatasesselama 7 menit, dantambahkankedalam chromosome denaturisasi yang telahdisiapkan. Hibridisasidilaksanakanselamasatumalampadasuhu 37oC didalamkamar/ruanglembab. Setelahhibridisasiberakhir slide dicucidilakukandua kali selamaduamenitpadasuhu 42oC dalam 2xSSC, dandua kali selama 5 menitpadasuhu 42oC dalam 0,1xSSC, dantiga kali selama 3 menitpadasuhu 42oC dalam 2xSSC. DeteksiDigoxigenin-labelled probe dibuatdengan antibody anti-digoxigenin yang digabungkandenganfluoresceinisothiocyanate (Roche). Deteksi Biotin-labelled probe dibuatdenganstreptavidin yang digabungkandenganTexax Red (Vector Laboratories) Setelahdeteksi, slide dicucidua kali selama 5 menitpadasuhu 37oC dansatu kali pada temperature kamardidalamdeteksipenyangga/buffer [4_ SSC, 0.2% (v/v) Tween 20]. Terakhir, slide dihilangkanwarnanyadengan DAPI dandikumpulkandidalamVectashield (Vector Laboratories). Tanda/signal hibridisasidianalisismenggunakanmikroskopepifluorescence Olympus, dengan filter set yang sesuai, dilengkapidengan camera digital Olympus Camedia C-2000-Z. Tampilan/image dioptimalisasiuntukkecerahandankontras yang terbaikdengan software imageprocessing (Adobe Photoshop v. 7.0)

10. Total DNA genomic daridaunmudadariM. arboreadanM. strasseridiisolasimenggunakan protocol CTAB yang dimodifikasioleh Doyle dan Doyle (1987). Untukpercobaan yang menggunakan genomic blocking, potongan/fragment DNA, panjang 100-300 bp, diperolehdengan autoclaving total genomic DNA darimasing-masingspesies GENOMIC DNA PROBES FOR GISH Probe DNA dariM. arboreadanM. strasseridilabeldengandigoxigenin-dUTP and biotin-dUTP, secaraberurutan, melalui nick tranlasi yang mengikutiinstruksipembuatan (Roche) DNA berlabeldariM. arboreadanM. strasseri , digunakanuntukanalisishubungan genomic dengan chromosome dari M. citrine, dicampurdalamkombinasi yang berbedadengan blocking DNA takberlabeldarispesies lain padakonsentrasi 50-fold excess dan 70-fold excess, dari DNA Escherichia coli. Dimanakedua species yang digunakanpadapercobaan genomic probe yang samadigunakankonsentrasi yang sama

11. Campuranhibridisasimengandung 2 µg mL–1darimasing-masingdigoxigenindan biotin-labelled genomic DNA, 50% (v/v) formamide, 10% (v/v) dextransulfatdan 2_SSC danblockin DNA takberlabel (50-dan 70-fold excess) didenaturisasidenganmendidihkanselama 10 menitkemudianditempatkandiatasesselama 7 menit GISHMetode in situ hibridisasimengikutiLeitch et al. (1994) danSchwarzacher and Heslop Harrison (2000) Ketikakedua probe dan chromosome telahdidenaturisasi probe diaplikasikanpada slide dan DNA-DNA in situ hibridisasidilakukanpadasuhu 37oC dalamkamarlembabselama 20 jam Sesudahhibridisasi slide dicucidilaksanakandua kali masing-masingselama 2 menitpadasuhu 42oC dalam 2xSSC, dua kali selama 5 menitmasing-masingpada 42oC dalam 0,1xSSC, dantiga kali selama 3 menitmasing-masingpadasuhu 42oC dalam 2_SSC. Secarakhususlarutanpencuci yang digunakanadalah: dua kali selama 2 menitmasing-masingpadasuhu 42oC dalam 2xSSC, dalam 20% formamidedan 0,1xSSC selama 10 menitpadasuhu 42oC, dua kali selama 5 menitmasing-masingpadasuhu 42oC dalam 2xSSC

12. RESULTSGambar 1. FISHdengan probe rDNA45S (hijau) dan5S (biru) padaselpucukakarMedicago marina (A,B), danM. arborea (C-F), M. strasseri (G-I) danM. citrine (J-L). Semuaseldiwarnaidengan DAPI (blue). (A) Nucleus interfaseMedicago marina menunjukkanduadaerahrDNA45S (hijau) danempatdaerahrDNA5S (merah); (B) M. marina, FISH gandadalamsel metaphase,; (C) M. arborea, nucleus interfase yang menunjukkanperenggangan locus rDNA 45S; (D) M. arborea, sel metaphase yang menunjukkan sub-terminal locus rDNA 45S; (E) M. arborea, sel metaphase yang menunjukkanempatdaerah proximal rDNA 5S; (F) M. arborea, FISH gandapada metaphase, yang menunjukkanduarDNA 45S danempatdaerah proximal rDNA 5S;

13. (G) M. strasseri, nuclei interfase yang menunjukkanpenggabungan locus 45S; (H) M. strasseri, nucleus interfase yang menunjukkanempattandahibridisasirDNA 5S; (I) M. strasseri, FISH gandadalamsel metaphase yang menunjukkanempatdaerah proximal rDNA 5S (merah) danduadaerah sub-terminal rDNA45S (hijau), (J) M. citrine, nucleus interfase yang menunjukkan signal darirDNA 45S; (K) M. citrine, nucleus interfase yang menunjukkansepuluhdaerahkompakrDNA 5S; (L) M. citrine, sel metaphase dengan signal FISH darirDNA 5S dan 45S, duapasang chromosome yang menunjukkan signal sangatkecilhibridisasi 5S. Kepala-panahmenunjukkanpasangan chromosome heteromorfik yang mengambarkanintensitas yang berbedapada signal hibridisasi45S. Skala bar = 10 mm.

14. Gambar 2. GISHpada chromosome metaphase dariM. citrinasecaraserempakdihibridisasidengan probe genomic M. arborea (A) danM. strasseri (B). Semuaseldiwarnaidengan DAPI (abu-abu). PadahibridisasisilangM. citrinadipotongpadasegmen terminal dan constriction sekunderdari chromosome yang ditempatkan (ditunjukkandengananakpanah). Skala bar = 10 mm

15. M. marina diploid (2n -= 16) memilikisatu 45S dandua 5S loci rDNA, suatupola yang biasanyaterdeteksipadapenelitiansebelumnyadarispesiesMedicago diploid. Namundemikian, spesiespoliploiddarigolonganDendrotelisterjadiseperti yang diharapkan. SpesiesM. arboreadanM. strasseritetraploid (2n = 32) memilikisatu locus 45S rDNAdandua loci rDNA5S, sedangkanpadaM. citrinehexaploidempatrDNA 45S dan lima rDNA 5S telahterdeteksi. Tidakada chromosome tunggaldariM. citrinadiberitanda yang samasetelahpenggunaan genomic probe dariM. arboreadanM. strasseri. Namun, tandahibridisasisilangpadaM. citrinaterbataspadalengan chromosome terminal dandaerah NOR

16. CONCLUSIONS Hasil FISH mendukunghubungan yang dekatantaraM. arboreadanM. strasseripadaspesiestetraploidtersebut, loci NOR pernahmengalamikejadiandiploidisasidengankehilanganurutanfisik, suatutampilancitogeniksehinggatidakditunjukkanpada genus spesies lain. Jumlahyang banyakdarirDNA loci danhasil GISH mendukung status khususuntukM. citrinahexaploid, daninididugabahwaspesiesinibukanautoploidketurunandariM. arboreaatauM. strasseri. Lebihlanjut, data molekulercitogenictidaksesuaihipotesisbahwaM. arborea and M. strasseritermasukdalamasaldariM. citrina. Peta FISH dapatdigunakansebagaialat yang efisienuntukmenentukankonstribusi genomic dariM. citrinapada hybrid somatic denganspesiesmedicago yang lain