Download
1 / 22
300 likes | 832 Views
ELECTROFOREZA ADN. STRUCTURA CHIMIC Ă A ACIZILOR NUCLEICI.
E N D
STRUCTURA CHIMICĂ A ACIZILOR NUCLEICI Acizii nucleici (ADN şi ARN) sunt molecule informaţionale care permit stocarea, transmiterea şi exprimarea mesajului genetic. Acizii nucleici sunt formaţi din catene polinucleotidice realizate prin stabilirea de legături covalente între nucleotide. Prin hidroliza acizilor nucleici în mediu acid se formează baze azotate, pentoze şi acid fosforic. Bazele azotate care intră în compoziţia acizilor nucleici pot fi baze purinice (adenina, guanina) sau baze pirimidinice (uracil, timină, citozină). ADN conţine timină, iar ARN conţine uracil. Pentozele se găsesc sub formă ciclică, β-furanozică. ADN conţine D2-deoxiriboză, iar ARN conţine D2-riboză. Structura nucleotidelor
Toate legăturile internucleotidice au aceeaşi orientare de-a lungul unui lanţ polinucleotidic, astfel că fiecare catenă are o anumită polaritate. In ADN cele două lanţuri polinucleotidice sunt antiparalele, adică unul evoluează în direcţia 5'→3', iar celălalt evoluează în direcţia 3'→5'. În mod convenţional, monomerii din secvenţa ADN sau ARN sunt reprezentaţi prin literele A, T, G, C, U. Structura unei catene este scrisă întotdeauna în direcţia 5'→ 3' (capătul 5' la care gruparea –OH de la C5' este liberă şi capătul 3' la care gruparea –OH de la C3' nu este angajată într-o legătură internucleotidică).
ELECTROFOREZA ADN Moleculele de ADN la pH fiziologic sunt încărcate negativ datorită grupărilor fosfat. Aceste molecule de ADN bicatenar vor migra către polul pozitiv la aplicarea unui câmp electric. Densitatea de sarcină este uniformă de-a lungul secvenţei astfel că în cazul fragmentelor liniare migrarea va fi invers proporţională cu mărimea acestor fragmente. Fragmentele de ADN de dimensiuni mici (mai mici de 500 de nucleotide) pot fi separate prin electroforeză în gel de poliacrilamidă. Fragmentele de ADN mai mari se pot separa prin electroforeză în gel de agaroză, evidenţierea făcându-se cu ajutorul bromurii de etidiu. Bromura de etidiu are proprietatea de a se insera între bazele azotate şi de a forma complexe necovalente de ADN. Bromura de etidiu poate fi vizualizată cu o lampă UV. Limita de detecţie a ADN este de 0,1 – 0,5 ng.
Solubilitatea ADN-ului în apă - Inelele glucidice, legate prin resturi fosfat constituie scheletul extern al dublului helix, în timp ce bazele azotate hidrofobe, sunt orientate spre interior şi perpendicular pe axa helixului; - Solubilitatea ADN-ului în apă se datorează tocmai orientării grupărilor fosfat spre exteriorul duplexului; - Toate grupările fosfat la pH = 7 sunt ionizate şi încărcate negativ.
ADNELECTROFOREZA ÎN GEL DE AGAROZĂ Electroforeza este o metodă simplăşi eficientă pentru separarea, identificarea şi purificarea fragmentelor de ADN de 0,5-25 Kb. La aplicarea unui câmp electric moleculele de ADN vor migra către anod (polul încărcat pozitiv) datorită sarcinii negative a grupărilor fosfat.
Materiale ·Tampon pentru electroforeză ·Soluţie de bromură de etidium ·Agaroză ·Loading buffer ·Marker de masă
Tampon pentru electroforeză TAE sau TBE TAE - Tris/Acetat/EDTA TBE -Tris/Borat/EDTA
Bromura de etidiu Øagent mutagen şi cancerigen (se inserează între bazele azotate din structura ADN-ului); Øsarcina globală a moleculei este pozitivă; Øse adaugă în gel pînă la o coloraţie slab roz;
Agaroza Øpolimer linear compus din reziduuri alternative de D şiL-galactoză reunite prin legături (1-3) şi (1-4) glicozidice;
Loading buffer-ul Øconţine sucroză si glicerol care vor creste greutatea probei cu ADN si o vor mentine in gel ; Øalbastru de brom fenol §la adaugarea soluţiei care conţine ADN se colorează în albastru datorită schimbării de pH; §permite vizualizarea frontului de migrare în gel.
Protocolul de lucru Protocolulde lucru cuprinde patru etape: 1.Prepararea gelului; 2.Incărcarea probelor de ADN în godeuri; 3. Migrareagelului la un anumit voltaj şi o anumită perioadă de timp; 4.Vizualizarea ADN-ului.
1.Prepararea gelului - se prepară volumul necesar de tampon pentru electroforeză – TAE 1x (dintr-o soluţie stoc TAE 50x ); - se cântăreşte cantitatea necesară de agaroză – gel de concentraţie 2%; ·- se dizolvă agaroza în tamponul de electroforezăpână la fierbere; - se toarnă gelul în cuva de migrare şi se îndepărtează eventualele bule de aer, înainte de întărirea gelului;
2.Incărcarea probelor de ADN în godeuri - Submers
3. Migrareagelului • 80 V • 90 min.
4.Vizualizarea ADN-ului - Colorarea gelului - Expunere directă la UV a gelului, în care a fost încorporată bromura de etidium
FACTORI CARE INFLUENŢEAZĂ MIGRAREA ADN ÎN GELUL DE AGAROZĂ 1.Mărimea fragmentelor de ADN - fragmentele de ADN linear migreazăîn gelul de agaroză cu o mobilitate care este invers proporţională cu masa moleculară; 2. Concentraţia gelului de agaroză – gelurile mai concentrate sunt folosite pentru migrarea fragmentelor de ADN mai mici; 3. Tamponul TAE este cel mai folosit; 4. Bromura de etidiu – moleculă încărcată pozitiv, se intercaleazăîntre bazele azotate din AND modificând mobilitatea acestuia, prin scăderea sarcinii negative a ADN-ului; 5. Voltajul – odată cu creşterea voltajului aplicat, fragmentele de ADN mai mari vor migra proporţional mai rapid decât cele mai mici. Rezoluţia cea mai bună la migrarea fragmentelor mai mari de 2 kb se obţine prin mentinerea unui voltaj de max. 5 V/ cm (valoarea în cm se referă la distanţa dintre electrozi).
