Application Guideline about the m ethods applied during the PHANE TRI project

1. Development of an in field, ecologically safe, continuously detoxifying technology for producing bio-vegetables PHANETRI Razvoj ekološke tehnologije sa kontinualnom detoksifikacijom zemljišta za proizvodnju bio-povrća u poljskim uslovima Szabadföldön alkalmazható, ökológiailag biztonságos, folyamatosan detoxifikáló technológia kifejlesztése bio-zöldségek termesztésére HUSRB/1002/214/068 Application Guideline about the methods applied during the PHANETRI project Alkalmazási Útmutató aPHANETRI projekt keretében alkalmazott módszerekről Uputstvo za metode primenjene u okviru PHANETRI projekta University of Szeged, Faculty of Science and Informatics, Szeged, Hungary Szegedi Tudományegyetem, Természettudományi és Informatikai Kar, Szeged, Magyarország Departman za mikrobiologiju, Fakultet prirodnih naukai informаtike, Univerzitet u Segedinu, Segedin, Mađarska

2. PHANETRI Guideline on methods applied in The aim of the project was the development of an in field, ecologically safe, continuously detoxifying technology for producing bio-vegetables. The developedstrategy is based on two components: a polyphenol oxidase secreting Trichoderma strain with mycoparasitic capabilities and the capability to elicit the systemic acquired resistance system in plants, and aPhanerochaete chrysosporium strain capable to degrade a wide spectrum of pollutants. A projekt célja egy szabadföldön alkalmazható, ökológiailag biztonságos, folyamatosan detoxifikáló technológia kifejlesztése volt bio-zöldségek termesztésére. A kidolgozott stratégia két komponensből áll: egy polifenol-oxidázt szekretáló, mikoparazita képességekkel rendelkező Trichoderma törzsből, mely képes a növények szisztémikus szerzett rezisztencia-rendszerének indukciójára, és egy Phanerochaete chrysosporium törzsből, mely a szennyezőanyagok széles spektrumának lebontására képes. Cilj projekta je razvoj ekološke tehnologije sa kontinualnom detoksifikacijom zemljišta za proizvodnju bio-povrća. Razvijena strategija se oslanja na dve komponente: enzim polifenol oksidazu koji proizvode gljive iz roda Trichodermasa mikoparazitičkim osobinama i sposobnostima da izazovu sistemski stečenu otpornost kod biljaka kao i sojPhanerochaete chrysosporiumkoji može da razgradi širok spektar zagađivača. Activities of the project • A special fungal strain collection containing distinct Phanerochaete and Trichoderma strains isolated from soil samples was established. • The best laccase producer fungi were identified in this collection with molecular methods. • The xenobiotic-degrading capabilities of the fungal strains in this collection was examined. • The antagonism spectra of the best Trichoderma strains against phytopathogenic fungi was explored. • The detoxifying activities of the best Phanerochaete and Trichoderma strains were studied. • The Systemic Acquired Resistance eliciting capabilities of the best Trichoderma strains was explored in tomato and pepper plants. A projekt tevékenységei • Talajmintákból izolált, különböző Phanero-chaete és Trichoderma törzseket tartalmazó speciális gomba törzsgyűjteményt hozunk létre. • A gyűjtemény legjobb lakkáztermelő gombáit molekuláris módszerekkel azonosításítottuk. • Felmértük a gyűjteménybe került gomba-törzsek xenobiotikum-bontó képességeit. • Feltérképeztük a legjobb Trichoderma törzsek növénypatogén gombákkal szembeni antagoniz-mus-spektrumát. • Vizsgáltuk a legjobb Phanerochaete és Trichoderma törzsek detoxifikáló aktivitását. • Felmértük a legjobb Trichoderma törzsek szisztémikus szerzett rezisztencia kiváltására való képességét paradicsom- és paprika-növényeken. Aktivnosti tokom trajanja projekta • Osnovana je nova kolekcija sojeva gljiva, iz roda Phanerochaete i Trichoderma izolovanih iz uzoraka zemljišta. • Primenom molekularnih metoda suidentifikovani sojevi gljiva iz nove kolekcije, koji su najbolji proizvođači peroksidaza i lakaza. • Ispitana je sposobnost razgradnje ksenobiotika sojeva gljiva iz ove kolekcije. • Antagonističke sposobnosti najboljih sojeva gljiva Trichodermaprema fitopatogenim gljivama je istražena. • Sposobnost detoksifikacije zagađivača je proučena među najboljim sojevima Phanerochaete and Trichoderma. • Sposobnost indukcije sistemski stečene otpornosti gljiva rodaTrichodermaje ispitana na paprici i paradajzu. 2

3. PHANETRI Experimental conditions Eksperimentalni uslovi Kísérleti körülmények A B C Molecular identification of Trichoderma and Phanerochaetestrains The fungal DNA extractions can be carried out from fresh mycelia with Aqua Genomic Solution Kit, according to the manufacturer’s instructions. The identification of the isolates can beperformed by amplification and partial sequence analysis of the internal transcribed spacer (ITS) region, using universal primers ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) and ITS5 (5’- GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’) according to WHITE et al. (1990). Sequence analyses can be carried using the NCBI BLAST program (ALTSCHUL et al., 1990, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) or in the case of Trichoderma isolates, with the aid of the TrichOKEY 2.0 online identification programme (DRUZHININA et al. 2005). Plates containing guaiacol- (A) and ABTS (B, C) used as indicators of laccase production Lakkáztermelés kimutatására alkalmazott guajakol- (A) és ABTS(B,C) -tartalmú táplemezek Petri kutije sa gvajakolom- (A) i ABTS (B, C) koji su korišteni kao indikatori proizvodnje lakaze Trichoderma és Phanerochaete törzsek molekuláris azonosítása A gombaizolátumok DNS-ének kivonása friss micéliumból történik az Aqua Genomic Solution Kit, felhasználásával, a gyártó utasításai szerint. Az izolátumok azonosítása a köztes átíródó elválasztó (ITS) régió amplifikálásával és részleges szekvenciaelemzésével történhet az ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) és ITS5 (5’- GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’) univerzális indítószekvenciák felhasználásával WHITE és mtsai. (1990) szerint. A szekvenciaelemzések az NCBI BLAST program (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST, ALTSCHUL és mtsai., 1990) felhasználásával, illetve Trichoderma izolátumok esetében a TrichOKEY 2.0 online elérhető azonosító program (DRUZHININA et al. 2005) segítségével kivitelezhetők. Sequence chromatogram of a fungal ITS region Egy gomba ITS-régiójának szekvenciakromatogrammja Hromatogram sa sekvencama ITS regiona kod gljiva Screening for laccase production Molekularna identifikacija sojeva Trichoderma i Phanerochaete For the screening for laccase-producing fungal strain, the medium contains: 0.5 %glucose,0.1 %yeast extract, 0.1% Na2HPO4, 0.2% KH2PO4 and 2 % agar. Guaiacol or ABTS are to be added for indicating the laccase activity. Ekstrakcija DNK iz gljiva može biti urađena iz svežih micelija upotrebom Aqua Genomic Solution Kit-a, prema uputstvima proizvođača. Identifikacija izolata se izvodi amplifikacijom i parcijalnom analizom sekvence ITS regiona, upotrebom univerzalnih ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) i ITS5 (5’- GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’) prajmera prema radu WHITE et al. (1990). Analize sekvenci izvode se upotrebom NCBI BLAST programa (ALTSCHUL et al., 1990, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) ili u slučaju sojeva Trichoderma korišćenjem TrichOKEY 2.0 online programa za identifikaciju (DRUZHININA et al. 2005). Lakkáztermelés vizsgálata A gombatörzsek lakkáztermelésének kimutatására alkalmazotttáptalaj 0,5 %glükózt,0,1 %élesztőkivonatot, 0,1% Na2HPO4-ot, 0,2% KH2PO4-ot és 2 % agart tartalmazott, guajakollal vagy ABTS-el kiegészítve. Skrining za produkciju lakaze Za skrining sojeva koji proizvode lakazu koristi se podloga koja sadrži: 0.5 %glukozu,0.1 %ekstrakt kvasca, 0.1% Na2HPO4, 0.2% KH2PO4i 2 % agar. Gvajakol ili ABTS je potrebno dodati za dokazivanje aktivnosti lakaze. 3

4. PHANETRI Experimental conditions Eksperimentalni uslovi Kísérleti körülmények Studies on the in vitro antagonism of Trichoderma isolates Trichoderma izolátumok in vitro antagonizmusának vizsgálata The in vitro antagonistic properties of the Trichoderma isolates against plant pathogenic fungi were examined on yeast extract glucose (YEG) agar at 25 °C. Agar discs (5 mm in diameter)cut from the growing front of 3-day-old colonies of the plant pathogen pregrown on YEG were inoculated onto the surface of media in Petri plates of 9 cm in diameter.After 24 h, mycelial discs of 2-day-old Trichodermacolonies were inoculated in the same way, 3 cm apartfrom the plant pathogens. The inoculationof Trichoderma strains was carried out in the mostprecise way in order to ensure the same availablespace for both fungi. Images (1800×1200) taken 10 days after the inoculation of Trichoderma were subjected to image analysis by the Scion Image v4.02 software. Biocontrol index (BCI) values were calculated as follows: BCI = (area of Trichoderma colony / total area covered by Trichoderma and the plant pathogenic fungus) × 100 (SZEKERES et al. 2006). A Trichoderma izolátumok növénypatogén gombák elleni in vitro antagonista képességeinek vizsgálata élesztőkivonat-glükózos agaron (YEG) történt 25 °C-on. A növénypatogén gombák YEG táptalajon előnevelt, 3 napos telepeiből kivágott, 5 mm átmérőjű agarkorongokat 9 cm-es Petri-csészékbe öntött táptalaj felszínére helyeztük.24 óra után 2 napos Trichoderma tenyészetekből ugyanúgy történt az inokuláció, a növénypatogén gomba oltási pozíciójától 3 cm-es távolságra. A Trichoderma törzsek leoltása a lehető legprecízebb módon történt annak érdekében, hogy mindkét gomba számára ugyanannyi terület álljon rendelkezésre. A Trichoderma leoltása után 10 nappal 1800×1200 pixeles felbontású fényképeket készítettünk, melyeker a Scion Image v4.02 szoftverrel végrehajtott képanalízissel elemztünk. A biokontroll index (BCI) értékeket a következőképpen határoztuk meg: BCI = (a Trichoderma telep területe / a Trichoderma és a növénypatogén gomba által együttesen elfoglalt terület) × 100 (SZEKERES és mtsai. 2006). Trichoderma asperellum Trichoderma atroviride Fusarium solani Schematic illustration of the procedure used for BCI determination A BCI meghatározására alkalmazott módszer sematikus ábrázolása Shema procedure koja se koristi kod određivanja BCI Botrytis cinerea Proučavanje in vitro antagonizma sojeva gljive Trichoderma In vitro antagonističke sposobnosti sojeva roda Trichoderma prema fitopatogenim gljivama je ispitan na agaroznoj podlozi sa glukozom i ekstraktom kvasca (yeast extract glucose-YEG) na 25 °C. Diskovi veličine 5 mm u prečniku su isecani iz agara na kome su se razvile kolonije fitopatogena stare 3 dana i inokulisane su na površinu YEG podloge u petri posude prečnika 9 cm. Nakon 24 h diskovi micelija 2 dana starih kolonija Trichodermasu inokulisane na isti način, ali 3 cm udaljene od inokuilisanog fitopatogena. Inokulacija sojeva Trichodermaje izvedena na veoma precizan način kako bi se obezbedio potreban proces za rast obe gljive. Slike (1800×1200) fotografisane 10 dana nakon inokulacije Trichoderma-e su analizirane upotrebom Scion Image v4.02 softvera. Vrednosti indeksa biokontrole (BCI) su računate na osnovu formule: BCI = (prostor zauzet kolonijama Trichoderma/ ukupna površina zauzeta kolonijama Trichoderma i fitopatogena) × 100 (SZEKERES et al. 2006). 4

5. PHANETRI Experimental conditions Eksperimentalniuslovi Kísérleti körülmények Application technology – plant- soil- fungi interaction In the pot experiment635 g of soil mixture was prepared (1:1:5 V ratio of soil:sand:peat ). Watering regime: 75 % of soil mixture water capacity. Lighting 14h day/ 10h night. 1 ppm of AFALONE active substance - linurone solution was applied in the pot and in the field experiment. After 2 daysPhanerocheate spore suspension(8x106 cfu) was added into soil planting space. Tomato and lettuce were transplanted 7 days after andTrichodermaspore suspension (2.5x105 cfu ) was added to the soil. Plant growth parameters were measured and linurone concentration in the soil samples was determined. Determination of linurone in soil: Soil samples were taken in pot and field experiments in 10 replicates. For determination of AFALON active substance-linuron the chromatographic system was used (Agilent chromatograph, Agilent 1220 Infinity LC).The column was a stainless steel Phenomenex Synergy 2,5 µ Fusion RP 100 A (50 mm x 2,1mm I.D.). The chromatographic conditions were as follows: eluent, methanol-water (65:35, v/v); flowrate, 0.4 ml/min; injection volume, 10 µl; wavelength, 254 nm. Column temperature was ambient. To obtain a solution of extractable linurone, 0.5 g of soil was shaken with 5 ml of water over 24 h. The suspension was then centrifuged at 14000 rpm for 30 min and the aqueous extract was separated. The response of the detector as referred to peak areas was linear in the range assayed (0.1-1.2µg//ml) and least squares linear regression analysis of the data provided an excellent correlation (R2=0.999). LOD was 0,03 µg/ml or 0,3 µg/g of soil. Tehnologija primene metode – interakcija biljka-zemljište-gljiva Saksije su sadržale 635 g smeše pripremljene od zemljišta, peska i treseta u zapreminskom odnosu 1: 1: 5. Biljke su zalivane do 75% maksimalnog vodnog kapaciteta. Režim osvetljavanja je bio 14h dan/10h noć. Aktivna supstanca AFALONA- linuron (1ppm) je dodat na zemljište u saksijama i na polju. Nakon 2 dana dodata je suspenzija spora Phanerocheate (8x106 cfu). Paradajz i salata su rasadjeni 5 dana posle, uz dodatak suspenzije Trichoderma(2.5x105 cfu ). Mereni su parametri rasta biljaka i određivana je koncetracija linurona u uzorcima zemljišta. Određivanje linurona u zemljištu: U okviru ekperimenata u saksijama i na polju, uzimani su uzorci zemljišta u 10 ponavljanja. Za merenje koncentracije linuronakoristio se hromatografski sistem Agilent (Agilent 1220 Infinity LC). Primenjena je kolona Phenomenex Synergy 2,5 µ Fusion RP 100 A (50 mm x 2,1mm I.D.) od nerđajućeg čelika. Uslovi razdvajanja su bili sledeći: eluent, metanol-voda (65:35, v/v); brzina protoka, 0.4 ml/min; zapremina uzorka, 10 µl; talasna dužina 254 nm, sobna temperatura. Priprema uzoraka za analizu- 0.5 g zemljišta je mućkano u 5 ml vode 24 h. Suspenzija je centrifugirana na 14000 rpm 30 min i vodeni eksrakt je odvojen. Odgovor detektora,(površina ispod vrha krive) je bio linearan u ispitivanom opsegu (0,1-1,2µg//ml). Regresiona analiza najmanjih kvadrata, izmerenih standarda pokazala je odličnu korelaciju.(R2=0.999). LOD je bio 0,03 µg/ml ili 0,3 µg/g of soil. Chromatogram obtained for extract of soil spiked with 1 µg linurone 1 µg linuronnal adalékolt talaj kivonatára kapott kromatogramm Hromatogram ekstrakta zemljišta u koji je dodat 1 µg linurona Alkalmazástechnológia – növény- talaj- gomba kölcsönhatás A cserepes kísérletben635 g talajkeveréket készítettünk(talaj:homok:tőzeg1:1:5 V arányú keveréke). Öntözési körülmények: a talajkeverék vízkapacitásának 75 %-a. Fényviszonyok: 14 óra nappal/ 10 óra éjszaka. Az AFALON aktív hatóanyagából, a linuronból 1 ppm-es oldatot alkalmaztunk a cserepes és szabadföldi kísérletekben. Két nap elteltével Phanerocheate spóraszuszpenzióval(8x106 cfu) kezeltük az ültetési területet. A paradicsom- és salátanövények ültetése ezt követően 7 nappal történt, ugyanekkor történt a talaj Trichodermaspóraszuszpenzióval (2.5x105 cfu ) való kezelése is. A növények növekedési paraméterei, valamint a linuron koncentrációja a talajban meghatározásra kerültek. A linuron meghatározása a talajban: A cserepes és szabadföldi kísérletekben a talajmintavétel 10 párhuzamosban történt. Az AFALON aktív hatóanyagának, a linuronnak a meghatározása kromatográfiás technikával (Agilent 1220 Infinity LC rendszer) történt, saválló acél Phenomenex Synergy 2,5 µ Fusion RP 100 A (50 mm x 2,1mm I.D.) oszlopon. A kromatográfiás körülmények a következők voltak: eluens, metanol-víz (65:35, v/v); áramlási sebesség, 0.4 ml/min; injektálási térfogat, 10 µl; hullámhossz, 254 nm. Az oszlop szobahőmérsékleten volt termosztálva. Az extrahálható linuron kinyerésére 0,5 g talajt rázattunk 5 ml vízzel 24 órán át. A szuszpenziót ezt követően 14000 rpm sebességgel 30 percig centrifugáltuk, és leválasztottuk a vizes fázist. A vizsgált tartományban (0,1-1,2µg//ml) a detektorjel (csúcsterület) és a koncentráció közötti összefüggés lineárisnak bizonyult, és alegkisebb négyzetek módszerével végrehajtott lineáris regressziós analízis korrelációs együtthatója kiválónak bizonyult (R2=0.999).A LOD érték 0,03 µg/ml-nek, vagy 0,3 µg/g talajnak adódott. 5

6. PHANETRI References/Literatura/Irodalom • ALTSCHUL S.F., GISH W., MILLER W., MYERS E.W., LIPMAN D.J. (1990): Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology 215, 403-410. • DRUZHININA i., KOPCHINSKIY A.G., KOMON M., BISSETT J., SZAKÁCS G., KUBICEK C.P. (2005): An oligonucleotide barcode for species identification in Trichoderma and Hypocrea. Fungal Genetics and Biology 42, 813-828. • SZEKERES A, LEITGEB B, KREDICS L, MANCZINGER L, VÁGVÖLGYI C (2006) A novel, image analysis-based method for the evaluation of in vitro antagonism. J Microbiol Methods 65, 619-622. • WHITE T.M., BRUNS T., LEE S., TAYLOR J. (1990): Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA for phylogenetics. In: INNIS M.A., GELFAND D.H., SNINSKY J.J., • WHITE T.J. (Eds.). PCR protocols: a guide to methods and applications. Academic Press, San Diego, CA, pp. 315-321. This document has been produced with the financial assistance of the European Union. The content of the document is the sole responsibility of theKNRET and the Department of Microbiology, Faculty of Science and Informatics, university of Szeged, Hungaryand can under no circumstances be regarded as reflecting the position of the European Union and/or the Managing Authority. Ovaj dokument je odštampan uz finansijsku podršku Evropske unije. Za sadržaj ovog dokumenta je odgovoran isključivo Departman za mikrobiologiju, Fakultet za nauku i informatiku i KNRET, Univerzitet u Segedinu, Mađarska i sadržaj ovog dokumenta ne odražava zvanično mišljenje Evropske unije i/ili Direktorata. Ez a dokumentum az Európai Unió pénzügyi támogatásával valósult meg. A dokumentum tartalmáért teljes mértékben a Szegedi Tudományegyetem, KNRET és a TTIK, Mikrobiológiai Tanszék, Magyarország vállalják a felelősséget, és az semmilyen körülmények között nem tekinthető az Európai Unió és / vagy az Irányító Hatóság állásfoglalását tükröző tartalomnak. 6