Лекция 8

1. Современные аспекты генетического анализа Лекция 8

2. Генетические задачи решаются легко только тогда, когда они предварительно уже решены другими. Поэтому необходимо предостеречь тех, кто впервые приступает к генетическому анализу, от уныния и пессимизма, если их первые попытки окажутся неудачными. Александр Сергеевич Серебровский

3. Вопросы • ПЦР – общие понятия и принципы работы. • ПЦР в реальном времени.

4. П Ц Р

5. Основные принципы ПЦР В 1983 году Мюллисом была разработана технология полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая получила очень большое распространение. В настоящее время ПЦР признана как наиболее производительная и относительно простая технология амплификации (многократного копирования) небольших количеств образцов ДНК, которая способна увеличить количество копий исходной пробы в миллионы раз в течение нескольких часов (Newton, Graham, 1997). Kary Baron Mullis Существующие методы полимеразной цепной реакции можно классифицировать по типам используемых праймеров. В ходе ПЦР могут быть использованы неспецифические (произвольные) праймеры (искусственно синтезированные нуклеотидные последовательности), которые комплементарно соответствуют тем последовательностям нуклеотидов, которые обычно с большей или меньшей частотой встречаются в геномах разных видов (random primedamplification — произвольно праймированная амплификация); и специфические праймеры, сконструированные (синтезированные) на основе тех нуклеотидных последовательностей, которые примыкают к изучаемому региону ДНК - группа STS-маркеров (Sequence-TaggedSites).

6. Основные принципы ПЦР. Random PCR В 1990 году, независимо друг от друга, две исследовательскиегруппы предложили для выявления полиморфизма ДНК использовать полимеразную цепную реакцию с одним коротким олигонуклеотидным праймером произвольной структуры. После электрофоретического разделения и визуализации продуктов ПЦР фрагменты амплифицированной ДНК различной молекулярной массы использовали как молекулярные маркеры для анализа генома. Одна группа (Williams et al., 1990) назвала такие молекулярные маркеры — RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA), другая (Welsh, McClelland,1990) - AP-PCR (Arbitrary Primer PCR). Несколько позже были предложены и другие похожие методы (Caetano-Anolles et al., 1991) - DAF (DNA Amplification Fingerprinting)(Булат и др., 1992) - УП-ПЦР (ПЦР с универсальными праймерами). Все они основывались па использовании одного праймера произвольной структуры и отличались только, в основном, длиной синтезированных праймеров. Достоинства метода: В случае применения "произвольных" праймеров нет необходимости в предварительном клонировании и секвенировании соответствующих фрагментов генома, в использовании гибридизации, авторадиографии или других достаточно трудоемких методов визуализации продуктов анализа.

7. Основные принципы Random PCR анализа (гаплоидные ткани)

8. Основные принципы ПЦР. Random PCR Произвольная амплификация является недетерминированнымпроцессом, не требующим предварительного знания матричной последовательности и использующим единичные или множественныесайты в геноме. Этот тип амплификации может использовать одинили несколько произвольных праймеров или комбинацию произволь-ного и направленного праймеров к специфическим, но неизвестнымсайтам в геноме, многие из которых являются полиморфными. rPCR (Random Polymerase Chain Reaction – произвольная ПЦР).Этот метод позволяет конструировать библиотеки полных кДНК из очень малого количества РНК (эквивалентного количеству РНК, содержащейся в одной эукариотической клетке, ста клетках бактерий или в ста тысячах частиц ретровируса). В качестве праймера для синтеза кДНК используют универсальный праймер, содержащий на 3'-конце гексамер с призвольной последовательностью (Froussard, 1993). RAPD анализ (Random Amplified Polymorphic DNA — произвольно амплифицированная полиморфная ДНК). ОригинальностьRAPD-анализа заключается в двух особенностях: при амплификации ДНК применяется только один праймер, так как мишенью являются, как принято считать, инвертированные повторы в геноме; для использования произвольных праймеров нет необходимости в предварительном клонировании и секвенировании соответствующих фрагментов генома. При подборе праймеров для RAPD-анализа достаточно выполнения следующих условий: олигонуклеотидная последовательность праймера должна содержать oт 50 до 80% G+C оснований, а его длина должна быть около 10 оснований.

9. Основные принципы ПЦР. Random PCR RAPD-анализ характеризуется следующими свойствами: при использовании большинства типов праймеров RAPD-спектрпредставлен 5-12 амплимерными зонами; RAPD-маркеры обладают доминантным характером проявления; RAPD не включает в себя гибридизацию/авторадиографию или другие трудоемкие методы визуализации продуктов анализа; RAPD чувствителен к изменениям ПЦР-условий, поэтому воспроизведение результатов можетбыть получено лишь при максимальной стандартизации условий. AP-PCR (Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction — произвольнопраймированнаяПЦР).В данном типе ПЦР используются праймеры, сходные по длине с таковыми в классической ПЦР (15- 25 нуклеотидов). Особенностью этого метода является проведение отжига праймера в нескольких первых циклах при более низкой, чем оптимальная, температуре (так называемый "мягкий" отжиг), что повышает эффективность праймирования при дальнейших "жестких" циклах. Продукты амплификации разделяют в агарозном геле и визуализируют бромистым этидием. DAF (DNA Amplification Fingerprinting фингерпринтинг ампл-ной ДНК). При DAF используют праймеры длиной 5-8 нуклеотидов. Сложные информационно насыщенные профили ДНК получают в полиакриламидном геле и окрашивают серебром для обнаружения пикограммовых количеств ДНК. В результате DAF с октамерным праймером образуются фингерпринтеры в 3-10 раз более сложные, чем ДНК-профили, полученные при RAPD-анализе с декамерным праймером. Техника DAF использовалась для характеристики многих организмов - от бактерий до человека.

10. Основные принципы ПЦР. Random PCR • Наибольшую популярность среди данного типа методов получил RAPD. Он использовался для всестороннего исследования генома организмов: конструирование генетических карт; • анализ генетической структуры популяций; • генотипирование; • маркирование признаков и др. • В то же время, этот и подобные ему методы были нелишены некоторых недостатков: • "произвольные" (случайные) маркеры, обладая доминантным характером проявления, не могли быть использованы при типировке гомозиготных и гетерозиготных амплифицированных образцов; • при интерпретации амплимеров, исходя из различной разрешающей способности применяемых гелей,необходимо было также учитывать и явление комиграции; • существовавшие проблемы воспроизводимости: результаты оказались очень чувствительны к изменениям ПЦР-условий, поэтому достоверные результаты можно было получить лишь при максимальной стандартизации условий.

11. Random PCR (RAPD, DAF, AP-PCR), AFLP – интерпретация результатов RAPD-спектр корневой губки при использовании праймера Oligo 12(диплоидные ткани, доминантный характер проявления аллелей) RAPD, DAF, AP-PCR, AFLP. Анализ полученных результатовпроводят визуально (RAPD, AP-PCR), либо с помощью специального программного обеспечения вследствие сложности электрофоретического спектра (DAF, AFLP). Данная группа маркеров характеризуется доминантным типом проявления и диаллельной системой: "1" - наличие ампликона(доминантный аллель) и "О" - отсутствие ампликона (рецессивный аллель), в той или иной зоне гелевой пластины. Исходя из доминантного характера проявления маркеров данной группы, различать гомозиготные (по доминантному аллелю) и гетерозиготные генотипы образцов, при использовании диплоидных или полиплоидных тканей, не представляется возможным. При характеристике организма описывается спектр(фенотип) ПЦР продуктов (таблица). Обозначение зон производится по названию праймера, отобранного для полимеразной цепной реакции, и размера зоны (в парах нуклеотидов) в надстрочнике. Так, например, зона размером в 670 п.н. в электрофоретическом спектре продуктов ПЦР с праймером Oligo 12 обозначается - Oligo 12670.

12. Random PCR (RAPD, DAF, AP-PCR), AFLP; CAP – интепретация результатов Важным моментом при проведении RAPD-анализа является необходимость использования только специфических зон для данного вида, поскольку включение минорных, артефактных зон может привести к искажению результатов анализа. Наличие артефактных зон может быть связано с загрязнением изучаемых препаратов чужеродной ДНК. Появление минорных фракций может быть вызвано, как наличием внешнего загрязнения, так и неправильно подобранными условиями отжига. Устранение минорных зон может быть достигнуто увеличением температуры отжига, снижением концентрации хлорида магния в реакционной смеси и т. д. Артефактные зоны из анализа исключаются и в дальнейшем не учитываются. При использовании новых RAPD-праймеров необходимо провести предварительное исследование воспроизводимости выявляемых спектров. По окончании сравнительного анализа следует оставлять только наиболее четкие зоны, обладающие полной воспроизводимостью. RFLP, САР. Интерпретацию полученных спектров проводят исходя из количества и величины (в парах нуклеотидов) выявленных зон. RFLP-спектр образцов дуба черешчатого при использовании комбинации рестриктазы Hindlll и пробы Rbkl 12 (диплоидные ткани, кодоминантныйхарактер проявления аллелей) Аллели: А— 1 зона: 2220 п.н. (отсутствие рестрикции), В — 2 зоны: 2120 п.н. и 100п.н., С — 2 зоны: 1660 п.н. и 560 п.н. Генотипы образцов Rbkl 12(HindIII): 1 —АВ, 2-5,7 — АА, 6 — АС, 8 — СС

13. Основные принципы ПЦР. Random PCR Таким образом, исходя из неспецифичности и доминантногохарактера наследования RAPD-локусов и сходных маркеров, использование данной технологии в популяционно-генетических и таксономических исследованиях, как оказалось, имело ряд ограничений. При проведении селекционных работ, наоборот, RAPD-анализ являлся достаточно эффективным методом, особенно для типировки генотипов, особей, клонов, форм и т.д. Это связано с большим количеством маркеров, выявляемых с помощью данного метода. При использовании даже одного какого-либо праймера, RAPD-спектр обычно представлен в виде пяти и более ампликонов, т.е. маркерных фрагментов. Таким образом, применяя различные праймеры, можно выявить и в дальнейшем использовать сотни генетических маркеров. Это позволяет сравнивать большое количество фрагментов ДНК, разбросанных по всему геному. Однако при определенных условиях эти достоинства становились недостатками данного метода. В ряде случаев некоторые амплифицированные фрагменты встречались у многих особей одногоили разных видов, что затрудняло их диагностирование. Для преодоления этой проблемы необходимо было синтезировать специфические праймеры для амплификации только конкретного гена или определенного фрагмента ДНК.

14. Основные принципы ПЦР. STS PCR Технологии, которые позволяют проводить ПЦР-анализ отдельных детерминант объединены под общим названием STS (Sequence-TaggedSites). В эту группу вошли такие методы как SCAR, EST, ISSR, CAPS, STMS и др.,отличающиеся по своим подходам к выявлению видоспецифических фрагментов.В случае метода SCAR(Sequence-Characterised AmplifiedRegions), первоначально с помощью ПЦР-анализа с произвольнымипраймерами устанавливают фрагменты, которые могут маркировать отдельные формы или виды, затем ампликоны вырезают изгеля, секвенируют для установления нуклеотидной последовательности и синтезируют специфические праймеры, комплементарныеначалу и концу данного участка ДНК (Antolin, 1996). При использовании метода EST (Expressed Sequence Tag)сна-чала выделяют из клетки специфичную для данного организмаматричную РНК, затем, с помощью фермента обратной транскриптазы, синтезируют кДНК, комплементарную этой мРНК, секвенируют ее и синтезируют праймеры для начала и конца гена,или его фрагмента(Karp et al., 1997). Одним из наиболее популярных методов, используемых дляидентификации организмов одного вида, явился SSR-метод (SimpleSequence Repeats), или STMS-метод (Sequence-Tagget Microsatellites),в основе которого лежит анализ микросателлитов.

15. Основные принципы ПЦР. STS PCR Амплификация со специфическими праймерами является де-терминированным процессом, требующим знания последовательности матрицы, а мишенью являются один определенный либо многочисленные сайты амплификации на обеих нитях ДНК. В зависимости от целей и задач исследований можно выделитьнесколько типов ПЦР со специфическими праймерами: VNTR (Variable Number of Tandem Repeats - варьирующеечисло тандемных повторов). Значительная часть повторяющейся (сателлитной) ДНК состоит из тандемно повторяющихся копий длиной1-6 нуклеотидов (микросателлиты, или SSR - Simple SequenceRepeat) и от 9-10 до несколько сотен нуклеотидов каждая (минисателлиты). Минисателлитный локус может насчитывать до нескольких сотен повторов, микросателлитный локус - до ста повторов. Мутации типа инсерция/делеция, изменяют число повторов, т. е. общую длину такой многокопийной последовательности. Таким образом, аллели данных локусов отличаются друг от друга числом тандемно повторяющихся копий. Большинство микросателлитных локусов полиморфны и имеют 5 и более вариантов. Применение этого метода в "ДНК-дактилоскопии" играет существенную роль. Так, например,использование только 5 микросателлитных локусов позволяет типировать особи в популяции с частотой ошибки менее 0,01%.

16. Основные принципы ПЦР. VNTR анализ Полиморфизм - существование более чем одного варианта последовательности ДНК (гена, маркера) с частотой, превышающей частоту обратного мутирования. (на практике >1%)

17. Основные принципы ПЦР. VNTR анализ Микро- и минисателлитные маркеры характеризуются кодоминантным типом проявления (за исключением "нулевых" аллелей). Таким образом, гомозиготные образцы представлены на фореграммах одной фракцией, а гетерозиготные — двумя (диплоидные ткани) и более (полиплоидные ткани) электрофоретическими вариантами. Схема выявления изменчивости для VNTR-локусов

18. Основные принципы ПЦР. STS PCR SCAR (Sequence-Characterised Amplified Regions - амплифицируемые регионы с известной нуклеотидной последовательностью). Данные маркеры представлены ДНК-локусами, для которых определена нуклеотидная последовательность). Если данная область является структурным геном или его фрагментом, то данный маркер обозначается как EST-маркер (ExpressedSequence Tag - экспрессируемые нуклеотидные последовательности). Дополнительный рестрикционный анализ SCAR-маркеров получилназваниеCAPS-анализ (Cleaved Amplified PolymorphicSequence - полиморфизм рестрикции амплифицированных нуклео-тидных последовательностей), или PCR-RFLP. Общий принцип выявления изменчивости SCAR-локусов (гаплоидные ткани)

19. Детекция полиморфизма по одиночным нуклеотидам (SNP) Общий принцип выявления полиморфизма SCAR-локусов (диплоидные ткани)

20. Основные принципы ПЦР. STS PCR Ассиметричная ПЦР. Используется для получения продуктов амплификации в одноцепочечной форме. Его суть заключаетсяв том, что один из двух праймеров для ПЦР берется в 100-кратномизбытке. На ранних циклах реакции происходит образование двухцепочечной ДНК и экспоненциальный рост ее количества. Как толькопул лимитирующего праймера исчерпывается (примерно к 20-муциклу), начинается образование одноцепочечной ДНК. Ее накопление носит линейный характер, но этого оказывается достаточно дляполучения одноцепочечной ДНК в количествах, необходимых длясеквенирования или использования в качестве зонда. Инвертированная ПЦР. Используется при изучении промоторных областей генов известных белков, сайтов интеграции провирусов, мобильных элементов. ДНК гидролизуется рестриктазой, вносящей разрывы не внутри известной последовательности, а в некоторых точках правее и левее ее. Образующийся фрагмент ДНК замыкается в кольцо с помощью ДНК-лигазы и амплифицируется в результате ПЦР. Основное отличие от стандартной ПЦР заключается в том, что праймеры, гибридизующиеся с концевыми участками известной последовательности, направлены З'-концами не внутрь ее, а наружу. В результате амплифицируются фланкирующие участки ДНК.

21. Основные принципы ПЦР. STS PCR Заякоренная ПЦР. Используется в случаях, когда для участка нуклеиновой кислоты, подлежащего амплификации, известна нуклеотидная последовательность лишь для одного праймера (напри-мер, в случае молекул РНК, для которых легко определить лишь 3'-концевую последовательность). Метод состоит в том, что с молекулы РНК получают кДНК-копию, к З'-концу которой пристраиваютполи(dG)-блок с помощью терминальной трансферазы. Амплификацию такой кДНК проводят при участии "заякоренного" праймера, содержащего на 3'-конце поли(dC)-последовательпость и потому гибридизующегося с поли(dG-блоком, и "специфического'" праймера, синтезированного на основании известной 3'-концевой последовательности РНК. Также имеются и другие STS-технологии, позволяющие диагностировать различные организмы. Анализ по ним проводится наосновании положительного или отрицательного результатов ПЦР-тестов. Аллель специфичная ПЦР.

22. П Ц Р в реальном времени

23. ПЦР в реальном времени. Основные протоколы. Методы ПЦР в реальном времени можно разделить на две основные группы, различающиеся по способам генерации портерной флюоресценции: 1) применение интеркалирующих флюоресцентных агентов, флюоресценция которых значительно возрастает при связывании с двухцепочечной ДНК (интеркалирующим красителем наиболее часто является SYBR Green); 2)использование меченных флюоресцентными агентами олигонуклеотидных проб, комплементарных участку PCR-продукта (протоколы TaqMan, Molecular Beacons и LightCycler).

24. ПЦР в реальном времени. SYBR Green протокол • SYBR Greenанализ базируется на детекции и количественом определении флюоресцирующих комплексов ДНК-SYBR Green(Morrison et al., 1998). Особенность красителя SYBR Green заключается в способности образовывать комплексы только с двухцепочечной молекулой ДНК, которая в ПЦР присутствуют только на стадии отжига (праймер-матрица ДНК) и элонгации (ампликон). Таким образом, изменение флюоресцентной эмиссии на конечном этапе элонгации каждого последующего цикла, восновном, отражает увеличение числа ампликонов в ходе ПЦР. • Достоинства: технология SYBR Green наиболее дешевая и простая в исполнении, позволяющая вносить элементы оптимизации в протекание реакции амплификации. • Недостатки: • применение SYBR Green накладывает очень высокие требования к специфичности реакции. Это необходимо иметь в виду при выборе праймеров; • отсутствие контроля специфичности образовавшегося продукта; • - при использовании данной технологии можно работать только с одной реакцией в одной реакционной смеси (в отличие, например, от TaqMan, где использование проб в одной реакционной смеси потенциально ограничивается возможностями конкретного амплификатора) и, при небольших количествах исходного образца ДНК, значительно уменьшается точность проводимого исследования.

25. ПЦР в реальном времени. TaqMan протокол TaqMan ПЦР основан на использовании 5'-экзонуклеазной активности полимеразы (Held et al., 1996). В реакционную смесь добавляют 2 праймера, комплементарных областям, фланкирующих амплифицируемый локус, и ДНК-зонд (проба), меченный на 5'-конце флюоресцентным красителем (Ф), а на 3'-конце — тушителем флюоресценции (Т). Зонд комплементарен участку, находящемуся внутри ампликона. Тушитель поглощает испускаемое флюоресцентной меткой излучение. При отжиге зонд связывается с комплементарным участком ДНК внутри ампликона. Во время стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и, дойдя до участка, гибридизованного с зондом, начинает расщеп-лять его за счет 5'-экзонуклеазной активности. В результате флюоресцентная метка отделяется от тушителя, и ее свечение можетбыть детектировано. Таким образом, увеличение флюоресценциипрямо пропорционально накоплению числа ампликонов.

26. ПЦР в реальном времени. TaqMan протокол Основным недостатком технологий, основанных на применениимеченных флюоресцентными агентами олигонуклеотидных зондов,и частности, TaqMan, является достаточно высокая их стоимостьпо сравнению с SYBR Green. Следует иметь в виду, что при использовании технологии TaqMan имеется меньше возможностей дляоптимизации реакции в отличие от применения интеркалирующихфлюоресцентных агентов, при неудачно подобранных комбинациях зондов и праймеров придется подбирать новые, что еще больше увеличивает стоимость исследований. При использовании в качестве образца молекулы РНК, а неДНК, в реакционную смесь добавляются реагенты для проведенияобратной транскрипции и в программе ПЦР на первом этапе выпол-няется синтез кДНК, которая будет выступать в качестве исходнойматрицы для последующей амплификации.

27. ПЦР в реальном времени. Molecular Beacon & Ligft Cicler Molecular Beaconsотличается от TaqMan тем, что концызонда (на которых находятся, соответственно, метка и тушительфлюоресценции) комплементарны друг другу (Mhlanga, Malmberg, 2001). В результате, при температуре отжига праймеров они схлопываются и образуют структуру типа "ручки сковородки" (stem-loop),где зона комплементарности зонда к изучаемому локусу находится в петле. При гибридизации зонда с матрицей вторичная структура разрушается, флюоресцентная метка и тушитель расходятся в разные стороны и флюоресценция от метки может быть детектирована. LightCycler технология основана на использовании двух зондов, меченных флюоресцентной меткой (Wittwer et al., 1997). Принцип метода заключается в переносе энергии от одного флюорофора,находящегося на 3'-конце первого зонда (Д), ко второму флюорофору, находящемуся на 5'-конце второго зонда (А), который происходит в том случае, когда расстояние между флюорофорами составляет 1-3 нуклеотида. Все описанные технологии различаются как по сложности постановки, так и по цене. Использование двух меченых зондов в ходеанализа делает данный метод одним из наиболее затратных.

28. ПЦР в реальном времени. Интерпретация результатов Real-Time qPCR. Данный метод анализа позволяет получатькак количественные данные о концентрации исходного локуса в образце (например, при изучении концентрации определенных видовмикроорганизмов в тканях тела или воде), так и качественные данные по генотипической структуре (генотипирование). При использовании SYBR Green протокола, генотипированиеосновано на индивидуальных значениях температур плавления различных ампликонов, что связано с варьированием размера и нуклеотидного состава изучаемых фрагментов ДНК. Для оценки температуры плавления ампликонов в конце программы амплификации проводят анализ кривой плавления получившихся ПЦР-продуктов. В большинстве случаев, поставляемое программное обеспечение, используя анализ производной функции интенсивности флюоресценции в зависимости от температуры (-dl/dT), представляетданные в виде пиков, отражающих температуры плавления ампликонов. В случае наличия одного пика — образец характе-ризуется наличием двух одинаковых аллелей, т. е. определяетсякак гомозигота. Если присутствует два различных пика — образецопределяется как гетерозигота.

29. ПЦР в реальном времени. Интерпретация результатов Кривые плавления гетерозиготного (слева) и гомозиготного (справа)по локусу QZag12 образцов дуба скального (диплоидные ткани)и их электрофоретические профили. При использовании анализа кривых плавления для генотипирования, важными моментами являются: отсутствие неспецифических ампликонов в ПЦР-спектре, которые могут давать ложные пики, а также наличие достоверных различий температур плавления аллельных вариантов. При выполнении данных требований, количество выявляемых аллелей может составлять 5-7 вариантов. Установление генотипа на основании использования TaqMan протокола, требует использования количества зондов, равного числуискомых аллельных вариантов. При одновременном использованиинескольких зондов в ПЦР-смеси, они должны отличаться спектрами испускания света для одновременной детекции на разных каналах (разных длинах волн) фотодатчика RealTime-термоциклера.

30. ПЦР в реальном времени. Интерпретация результатов Графики изменения интенсивности сигнала для гомозиготных игетерозиготных образцов при детекции двух различных длин волнв ходе TaqMan протокола. Генотипы образцов: 1 — АА, 2 — АВ, 3 — ВВ. Интерпретация получаемых результатов заключается в следующем: у гомозиготных организмов в ходе ПЦР будет происходитьрасщепление зонда только одного типа, и, соответственно, увеличение интенсивности свечения только в одном определенном волновом спектре. У гетерозиготных организмов в ходе реакции будетпроисходить расщепление зондов двух типов (в случае диплоидныхтканей) и, соответственно, нарастание сигнала для двух различныхдлин волн в спектре испускания.

31. ПЦР в реальном времени. Интерпретация результатов

32. ПЦР в реальном времени. Интерпретация результатов