MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DA DIVERSIDADE MICROBIANA

1. MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DA DIVERSIDADE MICROBIANA Anderson Barbosa Hadja Radtke Mariana Uchoa Tammy Arai Florianópolis, 24 de junho de 2010

2. Introdução • Diversidade microbiana – bactérias, protozoários, fungos e algas unicelulares Diversidade Homogeneidade (abundância relativa de cada grupo) Riqueza (no de grupos presentes) • Maior diversidade: muitas espécies em abundância relativamente igual

3. • Inventário atual da biodiversidade mundial – muito incompleto (vírus, microorganismos e invertebrados) 1,7 milhões de espécies vivas no planeta Representam apenas 1 a 10% de todas as espécies de bactérias 5.000 espécies identificadas de procariotos • Temos pequena idéia da nossa real diversidade microbiana

4. • Solo talvez seja habitat mais explorado para isolamento de microorganismos • Fontes naturais diversas oferecem ambientes ricos para exploração – água doce, matéria orgânica, sedimentos, folhas, frutos...

5. Grande diversidade fenotípica e genética das comunidades do solo – uma das mais difíceis de estudar 1% da população bacteriana do solo pode ser cultivada através das práticas comuns de laboratório Análise da diversidade de um ambiente: Estudos independentes de cultura Estudos dependentes de cultura X

6. Estudos dependentes de cultura • Bactérias isoladas de amostras do ambiente através de meio de cultura – ácido nucléico extraído • Problema: microorganismos viáveis mas não cultiváveis (não são metabolicamente inertes: sintetizar proteínas e usar substratos)

7. Estudos dependentes de cultura • São limitados - apenas bactérias que podem ser cultivadas • Não refletem a real estrutura da comunidade microbiana Maioria das bactérias será excluída quando diversidade for estimada

8. Métodos independentes de cultura • Extração direta dos ácidos nucléicos das amostras do ambiente – métodos moleculares • amplificação do DNA extraído por PCR e análise da diversidade das moléculas amplificadas: “fingerprinting” • produtos podem ser clonados e sequenciados: identificar e enumerar as espécies de bactérias presentes % muito maior de microorganismos, que não é cultivada em laboratório

9. Limitações dos métodos moleculares Primeiros requisitos e obstáculo a ser superado: extração e purificação dos ácidos nucléicos • método de extração do DNA ou RNA usado: muito suave gram + não são lisadas; muito severo DNA pode ser danificado • separação das células microbianas dos componentes do solo: substâncias inibitórias (ácidos húmicos) – se co-extraídas interferem na PCR Podem influenciar a análise e interpretação dos resultados das avaliações moleculares

10. Métodos para medir a diversidade microbiana no solo: Técnicas bioquímicas Técnicas moleculares • Conteúdo de guanina + citosina • Reassociação de ácidos nucléicos e hibridização • Microarranjos ou microchips de DNA • DGGE – TGGE • SSCP • ARDRA / RFLP • T-RFLP • RISA / ARISA • Contagem em placas • Nível fisiológico da comunidade (CLPP) • Microradioautografia • Atividade enzimática do solo • Analise de ácidos graxos (FAME)

11. Contagem de placas e Níveis fisiológicos da comunidade Diluição da amostra • Representa apenas microorganismos cultiváveis • Favorece organismos de rápido crescimento • Só representa os organismos capazes que utilizar a fonte de carbono escolhida • Mostra o potencial de diversidade metabólica e não a diversidade in situ. • Escolher condições de crescimento ótimas abrangentes • Impossibilidade de cultivar grande quantidade de espécies • Favorescimento de microorganismos com crescimento mais acelerado. Inoculação na placa Contagem dos viáveis Análise da capacidade da comunidade microbiana em utilizar determinadas fontes de carbono

12. Microradioautografia e FISH Através da quantidade absorvida por uma célula de um substrato específico marcado radioativamente, pode-se detectar e quantificar a população ativa que está usando esse substrato. FISH (Fluorescence in situ hybridization) usada para detectar a presença de uma sequência específica de DNA nos cromossomos. Usa-se um marcador fluorescente que liga-se à sequência escolhida e, através da microscopia de fluorescência pode-se visualisar a marcação. Permite elucidação da função ecológica dos microorganismos Permite elucidação da filogenética dos microorganismos

13. Atividade enzimática do solo As enzimas encontradas naturalmente no solo provém, principalmente, de microorganismos, apesar de resíduos animais e vegetais também serem uma possível fonte. Exoenzimas Atividade enzimática Endoenzimas • São avaliadas as atividades de enzimas do solo associadas: • ao ciclo do carbono b-glucosidase • do fósforo fosfatase ácida • do enxofre arilsulfatase Dessa forma, pode-se associar a atividade enzimática com o papel ecológico do microorganismo presente no solo

14. Análises dos ácidos graxos Esse método informa sobre a composição da comunidade microbiana baseado em grupos de ácidos graxos. coleta - Ácidos graxos - Ácidos graxos específicos de grupos taxonômicos Perfil saponificação metilação Uma mudança no perfil da comunidade significa uma mudança na microbiota extração lavagem Análise por cromatografia de gás

15. Técnicas moleculares para o estudo da diversidade microbiana Conteúdo guanina + citosina Reassociação de ácidos nucléicos e hibridização Microarranjos de DNA Técnicas de PCR DGGE – Eletroforese em gel de gradiente desnaturante

16. Técnicas moleculares para o estudo da diversidade microbiana • SSCP – Polimorfismo de conformação de fita simples • RFLP/ARDRA – análise de restrição do DNA ribossomal amplificado • T-RFLP – Polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição terminais • RISA - Análise de espaçador intergênico ribossomal • Rep-PCR – caracterização de sequências altamente repetitivas ou microssatélites

17. Conteúdo guanina + citosina • Diferenças na quantidade de guanina + citosina no DNA • Diversidade bacteriana de comunidades do solo • Diferem entre 3% e 5%

18. Conteúdo guanina + citosina • Vantagens de análises G+C • Sem influência de PCR • Inclui todo o DNA extraído • Pode detectar membros raros de uma comunidade • Método quantitativo

19. Conteúdo guanina + citosina • Análise de mudanças na diversidade microbiana no solo havaiano

20. Reassociação de ácidos nucléicos e hibridização • DNA total é extraído, purificado e desnaturado • A taxa de hibridização ou reassociação depende da similaridade das sequências • Tempo relacionado com a diversidade • Importante ferramenta qualitativa e quantitativa na ecologia molecular bacteriana

21. Reassociação de ácidos nucléicos e hibridização • Sondas de ácidos nucleicos • Sondas são pequenas porções de DNA (ou RNA) de sequência conhecida usadas para identificar a presença de DNA complementar na amostra • A ligação das 2 fitas (sondas + amostra ) se denomina HIBRIDIZAÇÃO • Hibridização pode ocorrer em suportes sólidos ou líquidos

22. Reassociação de ácidos nucléicos e hibridização • Desvantagens • Pouca sensibilidade • Sequências necessitam de um grande número de cópias para serem detectadas

23. Microarranjos ou microchips de DNA Microarranjos de DNA “DNA microarrays” Coleção de porções de DNA aderidas a suportes sólidos (vidro, plástico ou silicone) formando um conjunto que visa monitorar a expressão de múltiplos genes.

24. Microarranjos ou microchips de DNA

25. Microarranjos ou microchips de DNA

26. DGGE e TGGE

27. DGGE e TGGE • Analise de produtos de PCR de acordo com suas sequências de pares de base* • DGGE utiliza géis de poliacrilamida contendo um gradiente linear de desnaturantes ( uréia e formamida) • TGGE utiliza um gradiente térmico com concentração constante de uréia e formamida

28. DGGE e TGGE • Técnica rápida, relativamente barata e reproduzível

29. SSCP • Fitas simples formamestruturassecundáriasquedependem do seucomprimento e dasequência de bases • Detecçãoporautorradiografia dos produtos do PCR com marcadoresradioativosouporcoloração com nitrato de prata • Vantagens e desvantagenssimilaresao DGGE • Algumasfitaspodemformarmais de umaconformação

31. RFLP/ARDRA

32. RFLP/ARDRA • Enzimas de restrição – fragmentos de restrição • Separaçãopor gel agarose • Southern blot - Hibridização a um DNA de prova e detecção com moléculasradioativasoufluorescentes • Detecção de genótipos: MM Mmmm • Útilparadetectarmudançasestruturaisnascomunidadesbacterianasmasnãoparamedir a diversidadeoudetectargruposespecíficos • (Extração, PCR)

33. T-RFLP • Mesmo princípio da RFLP • Um primer do PCR é marcado com uma substância fluorescente • Leitura do padrão de banda simplificada • Uso de sequenciador automático – altamente reproduzível • Possibilita a análise de comunidades complexas e a coleta de informações sobre a diversidade, mas pode trazer distorções aos resultados (escolha primer)

34. RISA/ARISA • Região IGS entre as subunidades ribossomais 16S e 23S • Heterogeneidade – útil para diferenciar estirpes bacterianas diferentes e espécies muito próximas • RISA requer muito DNA, marcador de prata pode ser insensível • ARISA ainda possui as limitações tradicionais do PCR

35. Rep-PCR • Sequencias de DNA repetidas de 1-10 pb - microssatélites • Pode servir para diagnóstico da espécie ou linhagem • Sequência deve ser conhecida para uso do primer apropriado

36. Considerações finais • Grande número de métodos disponíveis para estudar diversidade microbiana do solo • Cada método tem suas limitações – fornece apenas um retrato parcial • Aconselhável utilizar uma variedade de métodos, incorporando resultados de métodos tradicionais e moleculares