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Electrophoresis

jana
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Presentation Transcript

    1. Electrophoresis

    3. ?????????????????????????? ???????????????? ??????????????????????????????????????????????????????????????? ??????????????????????????????????????????????????????????????? ?????????????????????????????????????????????????? ??????????????????????????????????????????????????? ?????????????? ??????????????????????????????? ????????????????????????? ???????????????????? (Electrostatics) ??????????? ???????? F electric ??????????????????????????????????????????????????????????????????? (Q) ?????????????????? ????? E ??? ????????????????????????????? Felectric = QE

    4. ????????????????????????????????????????????????? ????????????????????????? ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ????? Ffriction ?????????????? v ???????????????????????????? ??? f ??????????????????????????? (friction coefficient) ??????????????? ??????? ??????????????????????????????????? (state of salvation) ???????????????????????????? ????????????????????????????????? ??????????????????????????? ???????????????????????????????????? ?????? QE = vf

    5. ???????????????????????????????????????????????? ??????????? µ (electrophoretic mobility) ?????????? ??????????? ??2 / ????? – ?????? ????????????? ???????? µ = v = Q E f

    6. ?????????????????????????????????????? ????????????????????????????? ????????????????????????????????????????????????? ???????????? ?????????????????????????????????????????????? ?????????????????? ?????????????????????????? ????????????????????????????????????????????????????????????? ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ??????????????????????????????????????????????????? ????????????????????????????????????????????????????????

    8. ????????????????????????????????? 1. ??????????????????????????????????? (moving – boundary electrophoresis) ??????????????????????????????? ???????????????????????????????????????????????????????????? ????????????????????? ??????????????????????????????????????????????????????????????????? ???????????????????????? ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ???????????????????????????????? ?????????????????????????????????????????????? ?????????????????????????????????????????????????????????????? ??????????????????????? ? ?????????? ???????????????????????????? ??????????????????????????????????????????????????????

    10. 2. ????????????????????????? (paper electrophoresis) ???????????????????????????????????????????????????????????????????????? ???????????????????????????????????????????????????????????? ????????????????????????????????????????????????????????????? ?????????????????? ??????????????????????????? ????????????????????????????????????????????? ????????????? ???????????????????????????????? ?????????????????????????????????????? ???????????? High – voltage paper electrophoresis (?????????????????????????????????????????) ???????????????????????????? ?????????????????????????????????????? ????????????????????? ????????????????????????????????

    12. 3. ?????????????????????????????????? (Cellulose acetate electrophoresis) ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ???????????????????????????????????????? ???????????????????????????????????????? ??? ??????????????????????????????????? ????????????????????????????????????? ???????????????????????????????????????????????????? ???????? (isozyme) ???????? ?????????? (lipoprotein) ????????????? (haemoglobin)

    14. 4. ?????????????????????????? (Starch gel electrophoresis) ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ???????????????????????????????? ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 70 ° C ?????????????????????????????? ?????????????????????????????????????????????????????????????? ????????????????????????????? ??????????????????????? ?????????? ?????????????????????????????? ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ????????????????????????????????????????????????? (parafilm) ???????????????????????????????????? ????????????????????????????????????????????? ?????????????????????????????????????????????????

    16. 5. ????????????????????????????????????? (Polyacrylamide gel electrophoresis) ????????????????????????????????????????????????????????????? ??????????????????????????????????? ????????????????????????? ????????????????????????? ??????????????????????????????????????????? ??????????????????????????????????????????????????????????????????????? ????????????????????????????????? ?????????????????????????????? ??????????????????????????????????????????????? (Acrylamide) ????????????????????????????????????? 2 ?????????????????? (bifunctional reagent) ???? N, N’ – methylene – bis – acrylamide

    18. 6. ????????????????????????????? (Agarose gel electrophoresis) ?????????????????????????????????????????????????????????????????????? ???????????????????????????????????????????????????????????????????????? ????????????????????????????????????????????????????????? ?????????????????????????????????????????????????????????????????? 10 ??????????? (westermeier,Rl, 2001) ???????????????????????? DNA ??? RNA????????????????????????????????????????????????????? ???????????????????????? ????????????????? ?????????????????????????????????????? 35 – 95 °C

    20. 7. ???????????????????????????? (Capillary Electrophoresis : CE) ????????????????????????????????????????????????????????????????????? ???????????????????????????????? (HPLC) ??????????????????????????? ????????????????????????????????????????????????????? ????????????????????? ???????????????????????????????????????????????????????? (capillary Electrophoresis ; CE) ??? CE ??????????????????????????? ?????????????????? CE ????????????????????? HPLC ???? CE ??????????????? ???????????????????????? ???????????????????????? ????????????????????? CE ???????????????????????????? ??????????????????????? ????????????? ?????????????????????????

    22. Capillary Electrophoresis (CE) CE ????????????????????????????????????????????????? ???????????????????????????????????? ??????????? ?????????????? ?????????????????????????? CE ???????????????????????????????????????????????????????????? ??????????? electro-osmotic flow (EOF) ????????????????????????????????????????????? ????????????? CE ??????????????????????????????????????????????? ????????????????????????????????????????????????????????????

    23. ?????????????????????????????????????? ???????????????????????????????? 10 – 30 kV ??????????????????????? ?????????? 25 – 100 ?m ?????????????????????????????????????????????????????????????????? ?????????????????????????????????????????????????????????? ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ????????????????????????????????????????????? ??????????????????? ?????????????????????????????????????????? ?????????????????????????????????????? ????????????? ????????????????????????????? ?????????????????(electropherogram) ??????????????????????????????????? ????????????????????????????????? (electroendosmotic flow (EOF)) ?????????????????????????????????? ???????????????????????????????????? ????????????????????????????????????

    25. ???????????????????????????????? (Electroosmotic flow : EOF) ? ????????????????? CE ??????????????????????? HPLC ???????????????????????????? ???? EOF ??????????????????????????????? (Silanol Group (Si-OH)) ???????????????????????????????????? ????? pH ??? ??????????????????????????????????????? ????????????????? (ion) ????????????????????????????????? ???????????????????? 2 ???? ( Double Layers ) ??????????????????????????????????????? ( Fixed Layer ???? The Stern Layer ) ???????????????????????? (Diffuse Layer ) ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ???????????????????????????????????????? ??????????????????????????? ????????????????????????????? ???????????????????????????????????? ?????????????????????????????????????????????????????????????? (???????) ????????????????????? (??????)

    27. ?????????????????????????????????????????????????????????????? (polyimide) ?????????????????????????????? ????????? ?????????????????????????????? ??????????????????????????????????????????????????? ??????????????????????????????????????????????? ?????????????????????????? ????????????????????????????????????????????????????????? ?????????????????????????????? 25 – 100 cm ???????????????????????????? 50 – 75 ?????? ??????????????????????????????? ????????? ?????????? CE ???? ????????????????????????????????????????????????? ?????????????????????????????????????????? ????????????????????? ????????????????????

    28. ??????????????????????????????????????????????? (1) ?????????????????? (Sample Introduction ) ????????????????????? ?????? 10 – 100 nl ????????????????????????????????????????????????????????????????????? ?????????????????????????????? ????????????????????? ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ????????????????????????????????????????????????????????????????????????? (electrokinetic sampling) ???????????????????????????????????????????????????????????????????????? (2) ?????????? (Detectors) ????????????????????-???????? ???????????? ????????????? ???????????????????????????????? ????????????????? ??????????????? ??????????????????? (3) ???????????????? (Power supply) ?????????????????????????? 5 – 30 kV ?????????? 10 – 100 ?A

    29. ????????????????????????????????????????????????? ?????????????????????????????????????????????? (1) ????????????????????????????????????? ?????????????????????????? ??????????????????? ??????????????????????????????????????????????????????? ? ??????????????????????? ?????????????????????????????????????????????? ??????????????????????????????????????? ??????? HPLC ????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ???????????????????????????????????????????????????????????? ? ?????? ???????????????????????????????????????????????? HPLC

    30. ?????????????????????????????? CE ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ????? HPLC ???? ??????????????????????????????????????? ??????????????????????????????????????????????? ? ???????????????????????? ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ?????????????????????????????? CE

    31. (2) ????????????????? ?????????????????????????? ????????????????????????????????????????? ??? ?????????????????????????? ???????????????? ???? ??????????????????????????????????? ???????????? CE ????????? theoretical plates counts (N) ????????? ???????????????????? ( 3 ) ????? N ??? theoretical plates counts ??? ???????????????????????????????????????? D ??? ?????????????????????? (diffusion coefficient)

    32. (3) ???????????????????????????????????? (Stacking) ????????????????????????????????????? ??????????????? (stacking) ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? CE ????????? ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ???????????????????? 10 ???? ??????????????????????????????????? ???????????????????????????????????????????????????????????????????? ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ????????????????????????????????????????????????

    34. Micellar electrokinetic capillary Gel Electrophoresis (MECC) ????????????????? MEKC ?????????????????????????????? ????????????????????? surfactant ?????? ??????????????????????????????? Capillary Gel Electrophoresis (GCE) ???????????????????????????????? gel network ?????????????? biomolecules ???? DNA ?????????

    35. 4. Capillary Isoelectric Focusing (CIEF) ?????????? pH gradient ??????????????????????????????????????? ????????????????????? biomolecules 5. Capillary Electrochromatography (CEC) ?????????????????????? electrokinetic ?????????????????????????????????????????????? silica gel ???? stationary phase ????????????????????????????? electropheretic ??? chromatographic

    38. Sample Introduction Injection volumes ?????????????? 10 – 100 nl ??????????????????????????????????????????????????????????????? ?????????????????????????????? ???????? ionize ??????????????????? ??????????????????????????????????????????????????????? ??????????????????????????????????????? electrokinetic sampling ????????????????????????????????????????????????????????????????????????

    39. Detectors ???????????????? UV, conductivity, fluorescence, laser induced fluorescence ??? mass spectrometer ??????????????? UV diode detectors Power supply ?????????????????????????? 5 – 30 kV ?????????? 10 – 100 ?A

    40. ??????????????????????? (band broading) ??????? band broading ?????????? HPLC ???? electrophoresis ???????? ?????????????????? ??? CE ????????? ???????????????????????????????????????????????? ?????????????????????? ???????????????????? ????????????????????????????????????????????????? ????????????????? ??????????????? ??????????????????????????????????????????????? ?????????????????????????????????????????????????

    41. 2. Electroendoosmotic flow (EOF): ????????????????????????????? silanols ????????????? pH ???? ??????????????????????? silanol ??????

    42. ??????????????????????? ???????????????????????????? ????????????????????????????????????????????? ???????????????? ??????????????????????? ????????????????????? pH ??? ?????? pH ??????? 9 silanol ?? ionize ???????? EOF ???????? ???????? EOF ????????????????????????????????????????????? EOF ????????????????????????? ?????????????????????????????????????????? laminar flow ???????? HPLC ????????????????????????? HPLC ??????????????

    43. 3. on – capillary detection : ????????????????????? HPLC ??????????????????????????????????????????????????????????????? ?????????????? ??????????????????????? ?????????????????????? CE ?????????????????????????????????????????????????????????

    44. ???????????? CE

    45. Free solution Capillary Electrophoresis (FSCE) ????????????????? pH ??????????? ??????????????????? acid ???? basic group ?????? ??????????? charge – to – mass ratios ???????????????????????????? ???????? ??????????????????????????????????? ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ??????????? pH ????????????? ????????????????????? ????????????? ??????????????? pH ??? ????????????????????? ???????????? ??????????????? pH ??? ??????????????????????????????????????????

    47. Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography (MECC) ?????????????????????????????????????????????????? ?????????????????????????? CE ???????????????????????????????????? pH ??? ??????????????? surfactant ??? sodium dodecyl sulphate (SDS) ???????????????????????? ?????????????? surfactant ??? ?????????????????? ??????????????? hydrophobic tail ?????????????????????????????????????????????? ????????????????????????????????????????? surfactant ?????????????????????? ???????????????? EOF ??????? micelle velocity

    50. Capillary Electrochromatography (CEC) ?????????????????????????? CE ??? HPLC ????????????????????????????????????????? HPLC ????????????????????????????????????? ????????? partition ??? electrophoretic migration ???????????????? EOF ??????????????????????????????????? ???????????? ?????????????????????????????????????? HPLC ????????????????????? (broadening peak) ????????? HPLC ???????????????????????????????????? ???????????????????????????????????? 40 – 80 % ???????????????????????????? methanol ??? acetonitrile ???????? ?????????????????????????????????????????????????? ??????????????????????????????????????????????????????????????????? ??????????????????????????????

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