23 souches de E. faecium résistantes de haut niveau à la gentamicine (RHNG), dont 22 sont RHNS,

1. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B 96 kb 54kb Chr 2kb 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 563pb 354pb 317pb 96kb Fig 2. PCR des gènes ant(6')-Ia(563pb) et aph(3’)-IIIa (354pb).1 : Ladder 100pb ; les puits 2, 3, 4, 6, et 7 : des souches hébergeant les deux gènes ; 5 : E. faecalis JH2-2, témoin négatif ; 8 : souche hébergeant le gène aph (3’)-IIIa uniquement. Fig 1. Gel d’agarose présentant les produits de PCR du gène aac(6’)-aph(2’’), chez des souches de E.faecium.1: 100pb, 2 à 7 des souches de HNRG, 8: E. faecalis JH2-2 (control négatif). 96kb DETERMINISME GENETIQUE DE LA RÉSISTANCE AUX AMINOSIDES CHEZ ENTEROCOCCUS FAECIUM ISOLÉES AU CENTRE NATIONAL DE GREFFE DE MOELLE OSSEUSE Abbassi Mohamed Salah, Touati Arabella, Bouchami Ons,Achour Wafa, Ben Hassen Assia Service des laboratoires, Centre National de Greffe de Moelle Osseuse –Tunis Méthodes Introduction La résistance acquise de haut niveau (RHN) aux aminosides est de plus en plus rapportée chez Enterococcus faecium (E. faecium). Ce ci est du à l’acquisition de gènes codant pour des enzymes de modification des aminosides. Le but de notre travail est d’identifier les mécanismes intervenant dans la résistance aux aminosides et de détrminer le support génétique de la RHN à la gentamicine chez des souches de E. faecium isolés de patients neutropéniques • Identification : méthodes conventionnelles et Api 20 Strep (Bio-Mérieux). • Sensibilité aux antibiotiques : selon les normes CA-SFM. • Extraction des plasmides: méthode de lyse alcaline (1). • Amplification PCR : Les gènes codant la résistance aux aminosides ont été recherchés par PCR, aac(6')-Ia-aph(2")-Ie,aph(2")-Ib, aph(2")-Ic, aph(2")-Id, aph(3')-IIIa (HNRK), ant(6)-Ia (HNRS) et ant(4')-Ia (HNRT). • Électrophorèse en champ pulsé (PFGE) après digestion enzymatique de l’ADN génomique par SmaI et par ApaI (2). • Hybridation: Le support génétique du gène aac(6')-Ia-aph(2")-Ie a été déterminé par hybridation sur les gels du contenu plasmidique et de PFGE. Matériel • 23 souches de E. faecium résistantes de haut niveau à la gentamicine (RHNG), dont 22 sont RHNS, • isolées de coprocultures de patients neutropéniques. • E. faecalis JH2-2 et E. faecalis E9 (fournie par Pr. Roland Leclercq) utilisées respectivement comme contrôles négatif et positif pour la PCR du gène aac(6')-Ia-aph(2")-Ie. • E. coli K12- V517, marqueur de taille des plasmides (53,7 - 7,2 - 5,4 -5- 4 - 3 - 2,6 et 2kb). Résultats 3- Électrophorèse en champ et hybridation par la sonde du gène aac(6')-Ia-aph(2")-Ie 1- gènes de résistance aux aminosides 2 : Contenu plasmidique et hybridation par la sonde du gène aac(6')-Ia-aph(2")-Ie A B Fig 3. Gel représentatif du contenu plasmidique des souches de E. faecium Fig 5. Gel représentatif de PFGE de l’AND génomique des souches de E. faeciumdigéré par ApqI (A) et localisation du gene aac(6’)-aph(2”) (B). Fig 4. Gel représentatif de PFGE de l’AND génomique des souches de E. faeciumdigéré par SmaI (A) et localisation du gene aac(6’)-aph(2”) (B). • 21 souches hébergent 1 à 5 plasmides de 2 à 54 kb. • Deux souches n’hébergent aucun plasmide. • Le plasmide de 54kb a été retrouvé chez 20 souches. • L’hybridation par la sonde du gène aac(6')-Ia-aph(2")-Ie ne montre aucun signal positif sur aucun de ces plasmides. • 13 pulsotypes de PFGE, indépendament de l’enzyme, ont été identifiées • 3 microclones de souches fortement liées génétiquement (9 souches/ 2 / 2) isolées de patients hospitalisés dans la meme unité ou en unités differentes. • Un seul signal d’hybridation par la sonde du gène aac(6')-Ia-aph(2")-Ie localisé sur un fragment d’ADN de 96kb. Discussion • - Le gène aac(6')-Ia-aph(2")-Ie a été présent chez toutes les souches, et en association avec aph(3')-IIIa (22/23) et aph(2")-Id (14/23) •  associations fréquentes dans la littérature (3, 4) • L’émergence du gène aph(2")-Id chez nos souches évoquerait une sous estimation de la RHNG chez les isolats classées phénotypiquement à bas niveau de résistance à la gentamicine  prudence de prescription des aminosides (gentamicine, amikacine). • Le gène ant(6)-Ia, présent chez toutes les souches résistantes à la streptomycine, reste de loin le mécanisme enzymatique le plus décrit chez les entérocoques, le gène ant(9´) est rarement décrit (4). • Contenu plasmidique riche  pool génétique important pour la localisation des gènes de résistances  dissémination facile de la résistance. • Une hétérogénéité des souches démontre par PFGE, avec présence de microclones de souches fortement liées  Simple phénomène de colonisation par souches sélectionnées par le traitement de DDT à base de gentamicine (5,6). • La localisation de la bande d’ADN hébergeant le gène aac(6')-Ia-aph(2")-Ie est stable indépendament de l’enzyme utilisé pour la PFGE  élément génétique indépendant du chromosome  la définition conforme de plasmide. • La localisation plasmidique du gène gène aac(6')-Ia-aph(2")-Ie a été souvent rapportée (1). • Il s’agissait d’une dissémination d’un élément génétique, plasmide, dont l’identité reste a déterminé. Références . 1-Woodford N et al. Antimicrobiol Agents Chemother. 1993, 37: 681-684; 2- Descheemaeker P et al. Inter J Syst Bacteriol. 47: 555-561; 3- Zarrili R et al. Antimicrobiol Agents Chemother. 2005, 56: 827-835; 4- Kobayashi N et al. Epidemiol Infect. 2001, 126: 197-204; 5-Klibi N et al. J Chemother. 2006, 18: 20-6; 6- Udo EE et al. Microb Drug Resist. 2004, 10: 139-145