Amanda F. Sarmento Nathani C. B. Denardi Rafael L. Farinha

1. Design, síntese total e superexpressão funcional do gene lip1 de Candida rugosa codificando para uma grande lipase industrial Amanda F. Sarmento Nathani C. B. Denardi Rafael L. Farinha Disciplina: Engenharia de proteínasProf. Dr. Jesus A. Ferro Jaboticabal Setembro de 2013 S. BROCCA, C. SCHMIDT-DANNERT, M. LOTTI, L. ALBERGHINA and R. D. SCHMID, 1998

2. Design, síntese total e superexpressão funcional do gene lip1 de Candida rugosa codificando para uma grande lipase industrial Amanda F. Sarmento Nathani C. B. Denardi Rafael L. Farinha Disciplina: Engenharia de proteínasProf. Dr. Jesus A. Ferro Jaboticabal Setembro de 2013 S. BROCCA, C. SCHMIDT-DANNERT, M. LOTTI, L. ALBERGHINA and R. D. SCHMID, 1998

3. Introdução Lipases • As lipases (Triacilglicerolacil-hidrolases EC 3.1.1.3) são enzimas que catalisam a hidrólise de triacilglicerídeos na interface água/meio orgânico. • In vitro são enzimas versáteis devido a sua capacidade de catalisar a hidrólise e a síntese de uma grande variedade de ésteres, ou a resolução de misturas racémicas • De maneira geral, as lipases não requerem cofatores, atuam em ampla faixa de pH, são estáveis à altas temperaturas, que fazem com que sejam altamente aplicáveis em processos industriais (VILLENEUVE et al., 2000; HASAN, SHAH, HAMEED, 2006).

4. Introdução • Muitos processos tecnológicos utilizam catalisadores biológicos nas sequências de • conversão química. • As principais fontes de obtenção de lipases para aplicação industrial têm sido os microorganismos. Tanto micro-organismos eucariotos (leveduras) como procariotos (bactérias), são produtores de lipases e suas propriedades variam de acordo com a procedência. • O uso de enzimas nas indústrias possibilita o desenvolvimento de processos tecnológicos tão eficientes quanto aos realizados pela natureza (HASAN; SHAH; HAMEED, 2006) e sem causar riscos ambientais.

5. Introdução • Algumas aplicações da lipase: • Indústrias de detergentes; • Medicamentos; • Alimentos (panificação, queijos e chás); • Têxteis; • Cosméticos; • Biodiesel; • - Tratamento de efluentes;

6. Introdução Candida rugosa • - Trata-se de uma levedura do gênero Candida sp. • - As lipases de Candida rugosa estão entre as lipases comercias mais frequentemente utilizadas na hidrólise e a síntese de uma gama de ésteres de interesse comercial (Kotting & Eibl, 1994; • Vulfson, 1994). • - Na maioria das aplicações biocatalíticas preparações de enzima em bruto, obtidas com TCA (Ácido tricloroacético)do sobrenadante da cultura, são aplicadas.

7. Introdução • - Uma alta homologia de sequência (entre 60-70%) entre vários genes de lipase que foram clonados a partir de C. rugosa. • - Diferenças na glicolisação destas lipases podem contribuir para esta heterogeneidade. • - Várias isoformas de lipase foram isoladas a partir de preparação de enzimas comerciais , sendo mostrado que o produto do gene lip1 é o constituinte principal. • -Pelo fato das isoformas poderem diferir nos seus desempenhos catalíticos e suas propriedades poderem ainda ser afetadas pelos processos de purificação, pensou-se que a clonagem e expressão do gene lip1 seria a abordagem mais adequada para produção e caracterização de lipase pura de C. rugosa.

8. Introdução • - C. rugosa dimórfica obedece a uma utilização de códons em que o não-canônico tripleto CUG, um códon universal para leucina, é lido com serina. • - Na maioria das espécies de Candida sp., filogeneticamente relacionados , CUG é extremamente raro, com notável exceção de C. rugosa , onde responde por cerca de 40% do total de códons de serina. • - No gene Lip1, 20 dos seus 47 resíduos de serina, incluindo a Ser209 catalítica, são codificados por tripletos CUG. Como consequência, a expressão heteróloga de Lip1 em Saccharomycescerevisiaeresulta em uma lipase inativa. A troca de vários , ou mesmo a maioria, códons CUG por tripletos universais de serina (UCN, AGY) é necessária para expressão em hospedeiro heterólogo.

9. Introdução • Neste trabalho foram investigadas duas abordagens para a expressão da proteína funcional de Lip1 : • - Mutagênese de um gene Lip1 natural e a sua expressão em S. cerevisiae; • - Síntese química enzimática do mesmo gene. Três genes sintéticos recombinantes (slip1) foram construídos diferindo na sequência líder . Os genes recombinantes foram expressos em S. cerevisiae e Picha pastoris.

10. Introdução Picha pastoris • - É uma espécie de levedura metilotrófica. • Como em S. cerevisiae, a secreção pelas células requer a presença de uma sequência de sinal fundido com a proteína expressa. • Propriedades físico-químicas e catalíticas da lipase recombinante produzidas por P. pastoris, foram comparadas com as CRLs comercias, revelando que são idênticas.

11. Mutagênese sítio-dirigida do gene da lipase de C. rugosa • Cinco membros, pertencentes à família de multigenes de codificação para as lipases de C. rugosa. • Utilização da sequência Lip1 Melhor caracterizado; Estrutura cristalográfica resolvida; Codifica a principal isoforma da lipase; • Lip1 contém sequência genômica com uma única ORF de 1647 pb, o que corresponde a uma proteína de 549 resíduos com uma extensão N-terminal de 15 resíduos hidrofóbicos, que codificam um peptídeo sinal .

12. Mutagênese sítio-dirigida do gene da lipase de C. rugosa • A proteína madura Lip1 contém 46 resíduos de Serina, 19 delas codificadas por tripletos CTG. • A primeira tentativa de superar os problemas que ocorrem na expressão heteróloga foi a substituição, por mutagênese sítio-dirigida dos códons CTG por outros códons universais para Serina. Hierarquia dos resíduos de Ser, funcionalmente e estruturalmente mais importante a ser mutado.

13. Mutantes de Serina • Com base no alinhamento com outras Serinas-hidrolases e sobre a estrutura 3D da enzima são selecionadas oito Ser como alvo para mutagênese. • - Quatro genes mutantes, contendo um Nº crescente de resíduos de Ser restaurados.

14. Mutagênese sítio-dirigida do gene da lipase de C. rugosa • Genes mutantes foram clonados no vetor pEMBLyex4, contendo a sequência de indução. • Células de leveduras recombinantes, cultivas sob condições de indução, acumulam intracelularmente produto inativo do gene Lip1a um nível de 10-20mg/L da cultura. • Embora a análise da glicolisação de proteínas recombinantes tenha fornecido evidências de N-glicolisação, como no caso de Lip1 do tipo selvagem, sua secreção falhou sugerindo dificuldades no nível pós-transcrional.

15. Construção de um material sintético, com códons optimizados da lipase da C. rugosa

16. Expressão da lipase recombinante em P. pastoris e S. cerevisiae nl-slip 1 Gene sintético PCR PCR pp-slip 1 p-slip 1 Vetores pPIC-nl-slip1pPIC-pp-slip1pPIC-p-slip1 pY-nl-slip1pY-pp-slip1pY-p-slip1 pYES2 pPICZαB P. pastoris S. cerevisiae

17. Expressão dos genes sintéticos da Lip1 em P.pastoris • Pichia Pastoris e Metanol -> Fonte de Carbono • AOX regula Metanol • Secreção evidenciada por “anéis” nas placas de tributirina-metanol. • pPIC-pp-slip1 e pPIC-p-slip1 -> Atividade Overnight • pPIC-NL-slip1 ->Atividade (48h-72h) • pPICZ-alfa-B -> Sem atividade

18. Expressão dos genes sintéticos da Lip1 em P.pastoris • Seleção dos melhores clones através da formação de anéis. • Cultivo • Metanol 20mL (Fonte de Carbono) • Indução: 48h • Palmitato de p-nitrofenil -> Sobrenadante (Multiplas Inserções Genômicas) • Cultivo • BMMY 200 ml (Meio Rico Padrão) • Indução: 5dias

19. Expressão dos genes sintéticos da Lip1 em P.pastoris • Atividade da Lipase: • pPIC-p-slip1 • pPIC-pp-slip1 • SDS-PAGE • Única Banda de 60 Kda • Peso molecular já era esperado para a Lip1 • Nenhuma outra proteína foi secretada pela P.Pastoris 85 U/ml

21. Expressão dos genes sintéticos da Lip1 em P.pastoris • Outros testes executados • Western-Blott • Sequênciamento Amino-Terminal • Acúmulo de Lipase recombinante no meio Intracelular -> Seq. Pré-Pro Sinalizadora do Fator Alfa (pPIC-pp-slip1) -> Apenas Expressão • Não houve acúmulo -> Seq. Sinalizadora Natural -> Apenas Secreção • Seq. Líder sinaliza a secreção na P.pastoris, evitando o acúmulo. • Seq. Pré-Sinalizadora do Fator Alfa (pPIC-p-slip1) -> Secreção E expressão

22. Expressão dos genes sintéticos da Lip1 em P.pastoris • Clone pPIC-pp-slip1 com o maior nível de secreção de lipase • Fermentação com Biorreator • BMMY • pH 6 • 208h • Para melhorar ainda... • Fermentação Celular de Alta Densidade • 280h 125 U/ml 150 U/ml

24. Expressão dos genes sintéticos da Lip1 em P.pastoris • Produtividade de 500-600 U/L por hora. • Lipase Nativa na C.rugosa • Ácido Oleico X Metanol (Fonte de Carbono_ • Produção de 250 U/L por hora. • P.pastoris com lip1 tem o dobro da produtividade

25. Expressão dos genes sintéticos da Lip1 em S.cerevisiae • Transformantes obtidos por vetores: • pY-nl-slip1 • pY-pp-lip1 • pY-p-slip1 • Atividade lipásica • Placas de Tributirina-Galactose • Indução: 24h • 30ºC • Transformante obtido por vetor: • Pyes2 -> Não teve atividade

26. Expressão dos genes sintéticos da Lip1 em S.cerevisiae • Os melhores clones foram cultivados: • Erlenmeyes 2-L • 200mL meio de Glicose Mínimo • Até atingir Densidade Óptica 600 • 5 dias de indução -> Meio mínimo Galactose Atividade dos sobrenadantes: 5-7U/mL (vetores pY-pp-slip1, pY-p-slip1, pY-nl-slip1) • 12-17x menos efetivo que na P.pastoris em cultivo de pequena escala

27. Expressão dos genes sintéticos da Lip1 em S.cerevisiae • Para o gene natural e modificado -> Completa falha em relação a lipase • Sem Acúmulo • Sem Secreção

28. Caracterização da Lipase Recombinante • Elétroforese de poliacrilamida do plasmídio pPIC-p-slip1 da P.pastoris -> Única banda de 60 kDA. • Lip1 Nativa e suas Isoformas • A sequencia de aminoacidos da Lip1 contem três sítios potenciais de N-glicosilação nas posições 291, 314 e 351 • Após a Deglicosilação: • Perda de 3kDa -> 5% do peso eram carboídratos • Nas Lipases não recombinantes, o peso é de cerca de 3,6-8% de carboídratos • Realizada antes e depois da Desnaturação • Peso molecular igual

29. Caracterização da Lipase Recombinante • C.rugosa comercial • Lip1 ativa em 30-40ºC • pH 7 (Efetividade reduzida em 60% se elevado a pH 8) • Dois pI pouco diferentes (3,9 e 4)

31. Caracterização da Lipase Recombinante • Comparação da Especifidade de substratosentre lip1 e lipase da C.rugosa • Triglicerideos com variação em tamanho de cadeias de grupos acyl • Atividade Lipolítica Alta • Tricaproina (C8) • Tricaprina (C10) • Atividade Lipolítica Baixa • Trioleina (C18) • Atividade HIDROlítica Alta • Mantega de Cacau(C16-18)

33. Caracterização da Lipase Recombinante • Comparação da Especifidade de substratos entre lip1 e lipase da C.rugosa • Ésteres Metílicos com variação em tamanho de cadeias de grupos acyl (C6-C22) • Após a atividade da lipase, os acidos graxos foram quantificados por Cromatografia em Gás • Atividade Lipolítica Alta • C8 - C10 • Atividade Lipolítica NULA • C18 – C22

35. Caracterização da Lipase Recombinante • Comparação da Especifidade de substratosentre lip1 e lipase da C.rugosa • Ésteres Metílicos com variação em tamanho de cadeias de grupos acyl(C6-C22) • Após a atividade da lipase, os acidos graxos foram quantificados por Cromatografia em Gás • Atividade Lipolítica Alta • C8 - C10 • Atividade Lipolítica NULA • C18 – C22

36. Caracterização da Lipase Recombinante • Propriedades físíco-quimicas e catalíticas da Lip1 e CRL coincidem • Lip1 em P.pastoris -> Mais funcionalmente Ativa

37. Protocolo Experimental

38. Cepas, plasmídeos e meios E. coli: DH5a Plasmídeos: pUC19 e PCYTEXP1 PEMBLyex4 pYES (Invitrogen) pPICZαB (Invitrogen) hospedeiro paraamplificação do plasmídeo P. pastorisGS115 (Invitrogen) S. cerevisiae INVSC2 (Invitrogen) S. cerevisae X4004.3A Expressão da lipase recombinante clonagem expressão

39. Cepas, plasmídeos e meios P. pastoriscultivadaemfrasco de agitação a 30ºC Meioricopadrão S. cerevisiaecultivadaa 30ºC 0,67% (w/v) do meiomínimo: Base Nitrogenada de levedura(YNB) + aminoácidoapropriado de 50mg/mL e 2% glicoseou 2% galactosecomofonte de carbono PUC19 pCYTEXP1 cultivada a 37ºC Meio LB (Luria-Bertani) E. coli 100ug/mL de ampicilina ou 25 ug/mL de zeocina seleção dos clones transformados pPICZαB 1% de glicerol (BMGY) ou 0,5 de metanol (BMMY) indução

40. Cepas, plasmídeos e meios Para manter as culturas de levedurasfoiusado o meio YEPD (1% de extrato de levedura, 2% de peptona e 2% de dextrose) Para selecionarostransformantes de P. pastorisforamutilizadasplacascontendozeocina (100mg/mL) e meio YEPS (YEP + 2% de sorbitol)

41. Design do gene, síntese do cassete e montagem do códon do gene otimizado Gene foidivididoem 4 fragmentos de ca. 400pb cadaclonadosseparadamente 4 subcontruçõesresultantes: Apósremoção de mutaçõesindesejáveis Cassete I 4 oligonucleotídeos Cassete II Cassete III 6 oligonucleotídeos Cassete IV Cada cassete foi sintetizado em uma etapa corte abrupto Vetor de clonagem pUC19 digerido com Smal pUC-I pUC-II clonados em pUC19 pUC-III pUC-IV

42. Design do gene sintético Cassete I Cassetes II a IV 4 oligonucleotídeos 6 oligonucleotídeo gene Lip1

43. Construção dos vetores de expressãoLip1 Gene sintéticoLip1 (slip)foisubclonado passointermediáriopara a fusão: FragmentoBamHI de pUC(I-IV) estavaligadoem um vetor linear de BamHI → pCYTEXPI, originando pCY-slip1 vetor pCYTEXP1 sequência líder do fatorα de S. cerevisiae gene vetor pCYTEXPI pCY-slip1 BamHI

44. Construção de vetores de expressão de Lip1 PCR Sequência do fator alfa presente no vetor de expressão de P. pastoris (pPICZαB) Sequência que codifica a lipase Sequência que codifica a lipase Sequência que codifica a lipase primer complementar a sequência pPICZαB O produtoobtido da PCR foiclonadoemSphI/bluntlinearizado com pCYTEXPI, resultandoempCY-prepo-fator-α O fragmentoBglI de pCY-slip1, contendotoda a forma madura do gene sintético da lipase, foiinseridonoplasmídeodigerido (pCyprepo-fator-α),restaurandoassim o gene de resistência a ampicilina O plasmídeoobtido (pCYpp-slip1), contendo o gene sintético da lipase madura, fundiu a sequêncialíder prepo-fator-α, foidigerido (BamHI/bluntHindIII), e o fragmentoresultantefoiligadodentro de pPICZαB linearizado com XbaI/blunt-HindIII, gerando pPIC-pp-slip1. pCY-pp-fator-α contém os fragmentos: SphI, BglI + gene sintétido da lipase contém os fragmentos: SphI, BglI + gene sintétido da lipase fragmento resultante ligado em pPICZαB pPIC-pp-slip1 Sequência líder prepo-fator--α linearizado com XbaI/blunt-HindIII

45. Construção de vetores de expressão de Lip1 Como vetor de expressãoemcélulas de S. cerevisiae, foiusado um vetorcontendo um promotor forte de indução da galactose (GALI-GALIO). pPIC-nl-slip1foidigerido com BamHI e ligado a pYES2 com a mesmaenzima, e desfosforilado, originando PY-nl-slip1. PY-nl-slip1foiutilizadoparaclonagem no vetor pYES2 do gene sintético da lipase, procedidopelassequênciasprepo-sinalfatoralfa e pre-sinal. OsfragmentosHindIII-BsteIIcontendoos genes recombinantesforamisolados a partir de pPIC-pp-slip1 e pPIC-p-slip1, e inseridosem pYES2, digerido com a mesmaenzima. Osplasmídeosobtidosforamchamados de pY-pp-slip1 e pY-p-slip1, respectivamente.

46. Expressão de Lip1em:P. pastorisS. cerevisiae

47. Expressão de Lip1 emP. pastoris Cepa: GS115 Transformadas com o vetor pPIC-pp-slip1poreletroporação Transformantes → plaqueamentoemmeioseletivosólido (YEPD) contendozeocina Clones produtores de lipase → halo claro Todosostransformantesobtidos com pPIC-pp-slip1 exibiramatividadelipásicaapósincubação 'overnight' detecção de microorg. lipolíticos verificação da atividade da lipase transferência das colônias para placas de tributirina-metanol • incubadas a 30ºC • 48h • 0,1mL de metanol → adicionado a cada 24h emcadatampa célulasde Pichiatransformadas com pPICαB nunca formaram halos

48. Expressão de Lip1emS. cerevisiae Células de S. cerevisiae Invsc2 Transformadas com pY-nl-slip1, pY-pp-slip1 e pYpreLIPporeletroporação Transformantesforamplaqueadosemmeiomínimosólidocontendotributirina e galactose selecionadoscom base nacapacidade de crescimentonaausência de leucina selecionadospelaprodução e secreção de lipase halos transparentesnaplacacontendotributirina

49. Fermentações Realizadaem um biorreator 1-L a 30ºC emmeiopadrãorico BMMY Fermentação com altadensidade de células Biorreatores: inoculados com 50mL da cultura de balãocrescida 'overnight', com uma DO600=2-3 no meio BMGY mantidaem pH constante Monitoramento: atividadelipolítica dos sobrenadantes, peso úmido das células pH 6,0 pH 7,0 adição de metanolapós a cultura alcançar 75mg/mL de peso úmido adição de 5mL de metanol diariamente adição de HCl 2M, NaOH 2M

50. Caracterizaçãofísico-química e catalítica Realizadadiretamente com o sobrenadante da cultura, semqualquertipo de purificação medido rotineiramente com tributirina como substrato em um ensaio de pH-stat a 30ºC e pH 7,2 Atividade da lipase Atividade da lipase Atividade da lipase Atividade da lipase sobrenadante da cultura de pequena escala: ensaio com espectrotofômetro usando p-nitrofenil palmitato como substrato a 30ºC utilizou-se comosubstrato: • 20mM de triglicérides • 5% (w/v) de manteiga de cacauemulsificadoemágua • destiladacontendogomaarábica (20mg/mL) e usadacomouma • solução de substrato no ensaio de pH-stat a 30ºC e pH 7,2 Especificidade do substrato