LA MELAMINA

1. LA MELAMINA

2. INDICE: • Introducción • ¿Qué es la melamina? • ¿Para qué se adulteró? • Método oficial para la determinación de nitrógeno proteico en alimentos • Métodos propuestos para detectar este tipo de fraudes • Curiosidades del caso

3. INTRODUCCIÓN: • El escándalo de la leche adulterada con melamina mató a 6 niños y afectó a otras 300.000 personas. • Los bebés enfermos o incluso fallecidos fue por problemas renales. • El Grupo Sanlu, mayor fabricante de leche en polvo y empresa responsable, fue condenado a pagar 6 millones de € de multa. • 2 personas condenadas a muerte, 4 condenadas a cadena perpetua y otros 39 sospechosos. • La leche adulterada llegó a traspasar fronteras: Myanmar, Bangladesh, Gabón, Burundi y Yemen.

4. ¿PARA QUÉ SE ADULTERÓ? • CHINA Y SU PROYECTO AMBICIOSO: • Pretendía en 2008 tener el mayor incremento mundial en la producción de leche. • Para ello en 2007 diluyeron la leche con agua añadiendo melamina para no disminuir el contenido proteico  Falsear controles de calidad.

5. LA MELAMINA: • Fórmula química: C3H6N62,4,6-triamino-1,3,5-triazina • MELAMINA ≠ MELANINA (pigmento de la piel) • Poco soluble en agua. Sólido blanco. • APLICACIONES: • Adhesivos para hacer madera aglomerada, • Espumas con base de resina de melamina, • Abonos • Manufactura de papel

6. LA MELAMINA: • EFECTOS SOBRE LA SALUD: • Por sus propiedades Fisico-Químicas favorecen su precipitación en vías urinarias  Acumulación de melamina en el riñón  Insuficiencia renal (piedras en el riñón) • Problemas gástricos, asma y fibrosis pulmonar e incluso llegar a desarrollar cáncer y tumores.

7. MÉTODO OFICIAL PARA LA DETERMINACION DE NITRÓGENO PROTEÍCO EN ALIMENTOS Método Kjeldahl: consta de tres etapas. - Digestión de la muestra. - Destilación. - Volumetría ácido-base.

8. MÉTODO KJELDAHL 1. Digestión de la muestra: Proteína(s) + H2SO4(ac) + Catalizador(s) → CO2(g) + H2O (g) + NH4SO4(ac) 2. Destilación: NH4HSO4(ac) + 2 NaOH → NH3(g) + Na2SO4(ac) + H2O(g)NH3(g) + H2O (g) → NH4OH (ac) 3. Valoración ácido-base.

9. Análisis del nitrógeno proteico según el BOE • Preparación de la muestra: - Atemperar la muestra a 20ºC +/- 2ºC - Obtención de una dispersión homogénea de la materia grasa. • Determinación: -Introducción en el matraz Kjeldahl de: * Perlas de vidrio * Sulfato de potasio * Óxido de mercurio II rojo * 5 g de leche exactamente pesados * 20 ml de Ác. Sulfúrico 96% -Calentamiento de la muestra hasta obtener un contenido líquido y sin espuma. -Calentamiento más intenso y ebullición (1:30h) hasta obtención de líquido limpio e incoloro.

10. - Enfriamiento y adición de agua- Adición de ácido bórico e indicador en un erlenmeyera la salida del refrigerante.- Adición de NaOH que contenga sulfuro al matraz Kjeldahl- Calentamiento hasta ebullición- Destilación durante 20 min hasta ebullición a saltos- Enfriamiento del destilado y valoración con HCl 0,1M

11. Cálculo del contenido total de nitrógeno:Nitrógeno total %= [ 1,40N (V1-V0)] / PN= normalidad del ácido clorhídricoV1= volumen en ml de ácido clorhídricoV0= volumen en ml de ácido clorhídrico utilizado en el ensayo en blancoP= peso en gramos de la leche empleada en el análisisLa diferencia máxima entre dos determinacionesno debe sobrepasar el 0,005% de nitrógeno. - Realización de un ensayo en blanco. Muestra de 5gde agua.

12. TOXICIDAD DE LA MELAMINA • Dosis letal = 6g/kg de peso corporal. • FDA determina un nivel de hasta 2,5 ppm de melamina para adultos y un límite de 1ppm para fórmulas infantiles. • Técnicas sensibles y rápidas.

13. ESI-MS • Electronebulizador por ultrasonido. • Calibración previa con diferentes diluciones de melamina en leche. • Se nebuliza directamente 3mL de muestra líquida sin tratamiento previo  Detección por MS. • Límite de detección (muestra líquida) 500ppb • Límite de detección (muestra sólida) 270ppb • La sensibilidad se puede mejorar diluyendo la leche con agua pura.

14. ESPECTRO ESI-MS • Pico de melamina 127 m/z

15. ESI-MS • Ventajas: • Consume pequeña cantidad de muestra. • Análisis directo sin tratamiento de muestra. • Alta especificidad. • Excelente tolerancia con matrices complejas. • Rápida detección.

16. Electroforesis capilar de zona • Fundamento: • Se utiliza la fuerte polaridad de la melamina para lograr su separación. • Se emplea su excelente absorción en UV para determinar los niveles de residuos. • Detector utilizado: • UV con diodo en serie.

17. TRATAMIENTO DE LA MUESTRA • La muestra se extrae con ultrasonido durante 10 min. • Centrifuga a 4000 rpm durante 2 min • El sobrenadante se filtra (filtro de 0.45 micras). • Tiempo:15min

18. Condiciones de extracción • La melamina se extrae con TCA (acido tricloroacetico) al 1%. • Se eligió para precipitar las proteínas y disociar la melamina que es el objeto del análisis. • Se añade 1 mL de cloroformo para que después de la centrifugación sea mas fácil de decantar. • Después se utiliza una disolución tampón de NaH2PO4 a pH=3.2, para facilitar la extracción a la melamina como catión , protonando sus grupos amino. Al bajar el PH aumenta la resolución y la sensibilidad, pero a PH menores aumenta el ruido.

19. Resultados

20. Ventajas e inconvenientes • Ventajas: • Alta sensibilidad (0.01 ppm) • Distribución lineal de los datos r=0.9995 • Buena precisión. • Recuperación de la muestra. • Desventajas: • Tratamiento de la muestra.

21. DAPCI-MS Desorption Atmospheric Pressure Chemical Ionization Mass Spectrometry: Sirve para analizar directamente muestras, sin necesidad de tratamiento previo y sin contaminación química.

22. DAPCI-MS

23. DAPCI-MS Análisis de leche en polvo: Como primer paso, se obtiene la fragmentación característica de la melamina protonada.

24. DAPCI-MS

25. DAPCI-MS

26. DAPCI-MS Análisis de leche en polvo: Una vez conocido el espectro, podemos comprobar si una muestra está contaminada con melamina.

27. DAPCI-MS

28. DAPCI-MS Análisis de leche líquida: Es recomendable detectar el ácido cianúrico presente, ya que forma con la melamina un complejo que puede ser más tóxico que dicha sustancia.

29. DAPCI-MS

30. DAPCI-MS

31. DAPCI-MS • Límites de detección: • Leche en polvo: 0’1 - 10.000 ppm • Leche líquida: 6’6 - 0’01 ppb • Tiempo de análisis: rapidez determinada por la concentración de melamina y procesado de la muestra. Entre 30s y 5min.

32. DETECCIÓN MEDIANTE EL USO DE ESPECTROSCOPÍA EN NIR Y FTIR • IR-Medio: (Resolución 4 cm-1 , Rango espectral: 4000-650 cm-1) Se usan dos técnicas de muestreo para recolectar espectros: DRIFT (espectroscopía de reflectancia difusa) y ATR (espectroscopía de reflectancia total atenuada) Para el FTIR-DRIFT las muestras se mezclan con KBr (1:1), mientras que para el espectro en FTIR-ATR no es necesaria la adición de la sal. • IR-Cercano: (Resolución:2 cm-1, Rango espectral:12500-3500 cm-1) Se llenan viales de 15 mm de diámetro con 5g de muestra. No es necesario un tratamiento previo.

33. FTIR-ATR y FTIR-DRIFT para la melamina pura y para lalEche en polvo

34. Espectros de absorbancia delNIR para la melamina y lafórmula infantil

35. Espectros de absorbancia delNIR para la fórmula infantil adulterada

36. Comparación NIR FTIR • Los tres métodos son capaces de diferenciar si existe o no melamina sin equivocaciones en un corto periodo de tiempo. • NIR necesita poco tiempo para el análisis, ya que el polvo se sitúa directamente en los viales y el espectro es analizado en menos de 2 min. • FTIR necesita un tiempo algo mayor para el análisis (mostrado en la tabla 3). ATR sitúa la muestra directamente en el cristal ATR, y el DRIFT debe mezclarse inicialmente con KBr, prolongándose el tiempo de análisis a 5 min.

37. ESPECTROMETRÍA DE MASAS EN TÁNDEM (LTP-MS/MS) • Fundamento → se induce la fragmentación de los iones formados a través de la colisión de éstos con átomos de un gas con el fin de obtener información estructural. • La utilización de una nueva variante en la fuente de ionización → plasma de baja temperaturapermite determinar trazas de melamina en los complejos sin necesidad de tratamiento previo de la muestra

38. VENTAJAS • Análisis rápido y directo • Elevada sensibilidad • Elevado rendimiento • Elevada especificidad • Elevada precisión cuantitativa

39. MÉTODOS DE DETECCIÓN DE MELAMINA EN ALIMENTOS

40. COMPARACIÓN DE TÉCNICAS

41. BIBLIOGRAFÍA • (1) Chan EYY, Griffiths SM, Chan CW. Public-health risks of melamine in milk products. Lancet 2008;372(9648):1444-1445. • (2) Huang G, Ouyang Z, Cooks RG. High-throughput trace melamine analysis in complex mixtures. Chem Commun (Camb); Chemical communications (Cambridge, England) 2009(5):556-558. • (3) Mauer LJ, Chernyshova AA, Hiatt A, Deering A, Davis R. Melamine Detection in Infant Formula Powder Using Near- and Mid-Infrared Spectroscopy. J.Agric.Food Chem. 2009;57(10):3974-3980. • (4) Yan N, Zhou L, Zhu Z, Chen X. Determination of melamine in dairy products, fish feed, and fish by capillary zone electrophoresis with diode array detection. J.Agric.Food Chem. 2009;57(3):807-811. • (5) Yang S, Ding J, Zheng J, Hu B, Li J, Chen H, et al. Detection of Melamine in Milk Products by Surface Desorption Atmospheric Pressure Chemical Ionization Mass Spectrometry. Anal.Chem.(Washington, DC, U.S.); Analytical Chemistry (Washington, DC, United States) 2009;81(7):2426-2436. • (6) Zhu L, Gamez G, Chen H, Chingin K, Zenobi R. Rapid detection of melamine in untreated milk and wheat gluten by ultrasound-assisted extractive electrospray ionization mass spectrometry (EESI-MS). Chem Commun (Camb); Chemical communications (Cambridge, England) 2009(5):559-561.