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Margherita Strolin Benedetti

Distribution et transporteurs en pharmacocinétique GMP - Journées des 4 et 5 février 2004 - Maison de la Chimie - Paris. Contenu sanguin dans les échantillons tissulaires animaux : correction pour les études de distribution. Margherita Strolin Benedetti.

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  1. Distribution et transporteurs en pharmacocinétiqueGMP - Journées des 4 et 5 février 2004 - Maison de la Chimie - Paris Contenu sanguin dans les échantillons tissulaires animaux : correction pour les études de distribution Margherita Strolin Benedetti

  2. Eléments à considérer pour évaluer la concentration d’un médicament • La réponse pharmacologique d’un médicament est en général en corrélation avec: • sa concentration sanguine ou plasmatique • sa concentration tissulaire. • Il faut cependant tenir compte que les échantillons de tissu, en plus des composants cellulaires, contiennent : • du sang résiduel • du liquide extravasculaire /espace extracellulaire M. STROLIN BENEDETTI - Journées GMP - Février 2004

  3. Contamination sanguine • La distinction entrelaconcentration dans le sang résiduel du tissu& la concentration tissulaire proprement diteest difficileà faire. • Par ailleurs, il n’est pas possible de : 1. ‘nettoyer’ le tissu par perfusion car le médicament serait : • en partie éliminé du tissu • dilué par la perfusion. 2. éliminer totalement le sang du tissu. • Ainsi, dans lesétudes de distribution tissulaire de médicaments à faible volume de distribution ou extrêmement polaires(par ex. les composés d’ammonium quaternaire) qui sont principalement dispersés dans l’espace intravasculaire et extracellulaire, la marge d’erreur due à la contamination sanguineestimportante. M. STROLIN BENEDETTI - Journées GMP - Février 2004

  4. Volume de sang résiduel dans les homogénats de tissu • L’estimation de la concentration d’un médicament dans les tissus d’un animal d’expérimentation est généralement effectuée à partir d’homogénats de tissu. • Il est donc essentiel de connaître le volume de sang résiduel contenu dans un tissu prélevé pour corrigerla concentration de médicament mesurée dans l’homogénat du tissu de la quantité de médicament contenue dans le sang résiduel. M. STROLIN BENEDETTI - Journées GMP - Février 2004

  5. Influence de la méthodologie dans la détermination du volume de sang résiduel La détermination du volume de sang résiduel d’un tissu dépend de la méthode utilisée: • d’une part, pour marquer le sang • d’autre part,pourle sacrifice de l’animal & le prélèvement des organes et, par conséquent, de la perte plus ou moins importante de sang durant le prélèvement. M. STROLIN BENEDETTI - Journées GMP - Février 2004

  6. Méthodes d’évaluation du volume de sang ou plasma • Colorant Evans Blue(T1824) • Albumine du sérum/plasma humain/bovin marquéeà l’iode 131(t½ = 8 j)ou 125(t½ = 60 j) • Erythrocytes marqués au phosphore 32 (di-iso-propyl fluorophosphonate)(t½ = 14,2 j) , au fer 55(t½ = 2,7 années)ou au chrome 51 (Na2 51Cr 04) (t½ = 27,8 j) (Biewald & Billmeier, 1978) M. STROLIN BENEDETTI - Journées GMP - Février 2004

  7. Méthodes les plus fréquemment utilisées pour évaluer le volume de sang résiduel • Les deux méthodes les plus fréquemment utiliséessont : • l’albumine marquée à l’iode • lesérythrocytes marqués au chrome(lorsque le chrome 51 est utilisé comme marqueur, l’isotope est absorbé par les érythrocytes et se combine avec les globines des hémoglobines). • Cependant, les informations obtenues avec ces deux méthodes ne correspondent pas toujours. M. STROLIN BENEDETTI - Journées GMP - Février 2004

  8. Méthode de l’albumine marquée (1) • Avec cette méthode,il faut tenir compte des propriétés de distribution de l’albumine marquée. • Dans le système vasculaire, l’albumine subit une rapide dilution intravasculairesuivie d’unéchange plus lent entre les liquides vasculaires et extravasculaires. • Lavitesse d’échange : • dépend de la porosité de la membrane vasculaire • varie d’un tissu à l’autre, ce qui amène à distinguer 2 sortes de tissus : • Les tissus de type I • Les tissus de type II M. STROLIN BENEDETTI - Journées GMP - Février 2004

  9. Méthode de l’albumine marquée (2) • Tissus de type I : l’albumine marquée pénètre librement les membranes vasculaires.Elle est ensuite rapidement distribuée dans le liquide extravasculaire. • Tissus de type II : MASSE TISSULAIRE = COMPOSANTS CELLULAIRES MASSE TISSULAIRE = VOL. EXTRAVASCULAIRE + VOL. CELLULAIRE (Triplett et al., 1985) M. STROLIN BENEDETTI - Journées GMP - Février 2004

  10. Tissus de type I Ils comprennent notamment : le foie la rate la moelle osseuse dont les membranes vas-culaires sont connues pour être très poreuses. Tissus de type II Ils comprennent des tissus connus pour avoir des membranes vasculaires rela-tivement moins poreuses : le muscle le coeur le poumon les intestins (grêle et gros) l’estomac la peau le tissu adipeux. Méthode de l’albumine marquée (3)Classement des tissus en type I et type II M. STROLIN BENEDETTI - Journées GMP - Février 2004

  11. Méthode de l’albumine marquée (4) • L’équilibre intravasculairede l’albumine est atteint à 90% pendant les 2 premières min. • Par contre, la perte en albumine du compartiment plasmatique est lente : < 10% de l’albumine injectée passe hors de la masse vasculaire pendant les 2 premières h. • Un intervalle de 10 min entre l’injection d’albumine et le sacrifice de l’animal doit donc pouvoir permettre d’atteindre l’équilibre intravasculairetout en assurant une sortie très limitée de l’albumine marquée de la masse vasculaire. M. STROLIN BENEDETTI - Journées GMP - Février 2004

  12. Méthode des globules rouges marqués • Avec la méthode des globules rouges marqués qui restent dans le liquide vasculaire, > masse tissulaire obtenue par la méthode de l’albumine marquée,au moins pour la plupart des tissus de type I. • Avec cette méthode, on peut s’attendre à trouver desvolumes sanguins résiduels trop élevés pour la rate, une partie des érythrocytes étant stockée dans la rate et pouvant être libérée dans certaines circonstances. MASSE TISSULAIRE = LIQUIDE EXTRAVASCULAIRE + COMPOSANTS CELLULAIRES M. STROLIN BENEDETTI - Journées GMP - Février 2004

  13. Importance des méthodes de sacrifice des animaux et de prélévement des organes/tissus • Si la méthode de marquage du sang a beaucoup d’importance pour connaître le volume de sang contenu dans les tissus, celle utilisée pour sacrifier les animaux et prélever les organes ou tissus en a tout autant. • YU et al.(1991) ont mesuré le volume de sangcontenudans différents tissus de cobaye : • soit en conservant • soit en éliminant autant que faire se peut le sang résiduel des tissus avant l’excision des organes. M. STROLIN BENEDETTI - Journées GMP - Février 2004

  14. Procédé 1 : prélèvement de tissus vidés de leur sang des cathéters sont placés dans la veine jugulaireet dans l’artère carotide. 125I-albumine de sérum de bœuf est injectée dans la veine jugulaire. Après un intervalle de 10 min nécessaire pour atteindre l’équilibre, le sang est prélevé au maximumpar le cathéter placé dans la carotide et sonvolume mesuré. Les organes ou tissus sont excisés, essuyés et pesés. La radioactivité estmesurée dans un compteur gamma. Procédé 2 : prélèvement de tissus avec leur sang Un autre groupe d’animaux a été traité de la même façonmaisen limitant la perte de sang des organes ou tissus. Seule la quantitéde sangnécessaire pour mesurer la radio-activité sanguine a été prélevée. Méthodologie utilisée chez le cobaye par Yu et al.(1991) M. STROLIN BENEDETTI - Journées GMP - Février 2004

  15. Volume de sang contenu dans différents tissus de cobaye On observe unedifférence significative en fonction du procédé utilisé pour les organes suivants : • coeur • intestin • rein • foie • poumon • muscle • peau • rate. Elle est particulièrement importante dans le poumon (r = 2.5) , la rate (r = 2.2) et le foie (r = 1.9). M. STROLIN BENEDETTI - Journées GMP - Février 2004

  16. Triplett et al. (1985) : étude chez le rat avec une méthodologie similaire • Il est intéressant de comparer le contenu en sang des tissus de différentes espèces lorsque la même méthode de marquage du sang et qu’une méthode similaire de prélèvement tissulaire sont utilisées. • TRIPLETT et al. (1985) ont déterminé le contenu en sang de tissus de raten utilisant : • la méthode del’albumine sérique marquée comme pour la précédente étude chez le cobaye • une méthode de prélèvementdu sang et des tissuscomparable au procédé 2 chez le cobaye (tissus avec leur sang). M. STROLIN BENEDETTI - Journées GMP - Février 2004

  17. Triplett et al. (1985) : conditions d’expérimentation • Une canule a été insérée dans la veine jugulaireet une injection de 131I-albuminea été administrée 10 min avant sacrifice. • Au moment du sacrifice, l’abdomen a été ouvert et un échantillon de sang prélevé de la veine cave inférieure. • Les organes ont été prélevéset pesés. • La radioactivitédu sang et des tissus a étémesurée. M. STROLIN BENEDETTI - Journées GMP - Février 2004

  18. Comparaison des résultats chez le rat et le cobaye A méthodologie similaire, on constate que lesvaleursobtenues sontrelativement similaires. M. STROLIN BENEDETTI - Journées GMP - Février 2004

  19. Point sur la littérature • Le contenu en sangdes tissus a également été étudiépar d’autres auteurs tels que : • Khor et al.(1991)etBiewald & Billmeier(1978)pour le rat • Bosse & Wasserman(1970)pour le cobaye • ainsi que Kaliss & Pressman pour la souris. • Les informations disponibles sur le volume de sang contenu dans les tissus de chien sont plus rares. C’est la raison pour laquelle desexpériences préliminaires chez le chienont été effectuées par UCB en collaboration avec l’équipe du Prof. Giudicelli(Giudicelli et al., Fund. Clin. Pharmacol., accepted for publication). M. STROLIN BENEDETTI - Journées GMP - Février 2004

  20. Etude chez le chien : conditions d’expérimentation • L’125I-albumine a été injectée i.v. dans la veine radiale. • 10 ml de sang veineux ont été collectés 15 min après injection d’albumine. • Les animauxont ensuite été sacrifiés. • Les organessuivants ont été prélevés puis des échantillons isolés : • Cœur=> 1 échantillon deseptum, de ventricule gauche & de ventricule droit • foie=> 2 échantillons différents • muscle de la cuisse=> 3 échantillons différents • Cerveau=> 1 échantillon de cortex, de cervelet &dezone sous-corticale. • Les différents échantillonsont étéimmédiatement pesés. • La radioactivitéde tous les échantillons (sang et tissus) a été mesurée dans les 3 h qui ont suivi le prélèvement. M. STROLIN BENEDETTI - Journées GMP - Février 2004

  21. Méthode de prélèvement des tissus chez le chien La méthode de prélèvement des tissus chez le chien est davantagecomparable à celleutiliséechez le cobaye et le rat avec le sang conservé dans les tissus, sauf pour le cœur où la perte en sang due à la séparation du cœur en 3 parties a été plus importante que pour les autres tissus. M. STROLIN BENEDETTI - Journées GMP - Février 2004

  22. Comparaison des résultats chez le rat, le cobaye et le chien A méthodologie similaire, les valeursobtenues sont assez similaires dans les 3 espèces. plus proche de la valeur chez le cobayelorsque lesangestéliminéautant que possible (146 µl/g) que lorsque le sang est conservé dans les tissus (252 µl/g). M. STROLIN BENEDETTI - Journées GMP - Février 2004

  23. Calcul de la concentration réelle de médicament dans les tissus (Yu et al., 1991) • La concentration réellede médicamentdans le tissu (C’T) a été calculée parla formule (a) : tenant comptede la quantité de médicament due à la contamination sanguine mais aussi du poids du sang résiduel. • Comme on connaît le plus souvent la concentration plasmatique(Cp), l’équation (a) devient : C’T = (CT – CB x F) (1 – F) CT = concentration apparente de médicament dans le tissu,CB = concentration de médicament dans le sang, F = contenu en sang (µl/g de tissu). C’T = (CT – Cp x R x F) (1 – F) R= CB / Cp. M. STROLIN BENEDETTI - Journées GMP - Février 2004

  24. Sur- & sous-estimation des concentrations tissulaires de valproate mesurées chez le cobaye (Yu et al., 1991) • L’étude de la distribution du valproate (300 mg/min/kg, perfusion i.v., état d’équilibre) a montré que les concentrations tissulairesmesurées étaientsur-estimées, surtout pour : • D’un autre côté, la concentration rénale du médicament a étésous-estimée à cause de la concentration de médicament plus élevéedans ce tissuque dans le sang. M. STROLIN BENEDETTI - Journées GMP - Février 2004

  25. Distribution de la phencyclidine chez le rat Khor et al. (1991) ont étudié la distribution tissulaire de la phencyclidine (400 ng/kg, single dose i.v.) chez le rat à l’aide d’érythrocytes marqués au 51Cr. Sans la correction du sang résiduel, des sous-estimations d’environ 30 et 25 % ont été trouvées respectivementpour le poumon et la rate . M. STROLIN BENEDETTI - Journées GMP - Février 2004

  26. Sur- & sous-estimation des concentrations tissulairesde cétirizine mesurées chez le chien (1) La distribution tissulaire de la cétirizine(0.1 et 0.6 mg/kg/j x 3 j, p.o.), a été étudiée chez le chien 2 h après la dernière dose. Les concentrations réelles du médicament dans les tissus ont été calculées avec la formule précédemment montrée. M. STROLIN BENEDETTI - Journées GMP - Février 2004

  27. Sur- & sous-estimation des concentrations tissulairesde cétirizine mesurées chez le chien (2) • Sans correctiondu sang tissulaire résiduel, les concentrations tissulaires de cétirizine mesurées sont : • sous-estimées dans le foie(- 13.6 %) • légèrement sur-estiméesdans le cerveau(cortex : + 4.7 %; cervelet : + 5.3 %; zone sous-corticale : + 6.3 %). • Par contre, il n’est pas nécessaire d’effectuer une correctiondes concentrations mesurées qui tienne compte du sang tissulaire résiduel pour le cœuret le muscle. M. STROLIN BENEDETTI - Journées GMP - Février 2004

  28. Simulation des % de sur- & sous-estimation des concentrations tissulaires mesurées pour un médicament selon le rapport CT/CB(1) CT/CB de cétirizine (2.39) (1.11) (0.37) (0.77) M. STROLIN BENEDETTI - Journées GMP - Février 2004

  29. Simulation des % de sur- & sous-estimation des concentrations tissulaires mesurées pour un médicament selon le rapport CT/CB(2) Si le % de sur- & sous-estimation acceptable est ≤ 20 %, la correction du sang résidueldoit êtreenvisagée pour : &1 ■ ■ ■ M. STROLIN BENEDETTI - Journées GMP - Février 2004

  30. Etude chez le chien Cette étude préliminaire devrait être complétée par des mesures du contenu en sang d’autres tissus, en particulier : - le poumon - le rein - la rate dans lesquels, tout comme pour le foie, le volume de sang contenu par g de tissu est particulièrement élevé. M. STROLIN BENEDETTI - Journées GMP - Février 2004

  31. Conclusion Lors des études de distribution d’un médicament, la nécessité d’effectuer une correction des concentrations tissulaires mesurées pour tenir compte de la contamination par le sang résiduel dépend : • de laquantité de sangcontenuedans chaque tissu • du rapport concentration tissulaire apparente / concentration sanguinedu médicament à l’étude. Pour une étude donnée,on peut prédire par des simulationssi la correction paraît opportune et dans quel tissu. M. STROLIN BENEDETTI - Journées GMP - Février 2004

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