Bibliotecas de Fragmentos para Inferência de Estruturas de Proteínas

1. Bibliotecas de Fragmentos para Inferência de Estruturas de Proteínas Tiago Edmundo Ribeiro Brito Orientadora: Katia S. Guimarães Mestrado em Ciência da Computação

2. Roteiro • Proteínas e sua Importância • Estruturas das Proteínas • Determinação da Estrutura 3-D • Bibliotecas de Fragmentos • Trabalho Proposto • Conclusões

3. Proteínas • Proteínas são polímeros cuja unidade básica é o aminoácido. • São os principais e mais abundantes componentes orgânicos da célula, participando das estruturas celulares e dos processos bioquímicos da fisiologia celular.

4. Estruturas das Proteínas • Níveis Estruturais • Est. Primária (Seqüência de Aminoácidos) • Est. Secundária (Arranjos Recorrentes dos R) • Est. Terciária (Conformação 3-D) • Função x Forma 3-D

5. Determinação da Est. 3-D • Métodos Experimentais: • Cristalografia • Ressonância Magnética Nuclear • Extremamente precisos, porém caros e instáveis • Métodos Teóricos: • Homologia ou Modelagem Comparativa (tradicional) • Bibliotecas de Fragmentos (nova tendência)

6. Homologia • Baseia-se na comparação entre as proteínas-alvo e outras cuja estrutura já seja conhecida • Alinhamento entre proteínas homólogas e o alvo • Verificação de proximidades locais • Construção e validação do modelo total • Desvantagens • Requer pesquisa de proteínas homólogas • Processo iterativo, com aplicação de restrições ao final de cada passo

7. Bibliotecas de Fragmentos • Baseia-se na construção de conjuntos de fragmentos representativos de proteínas • 1986, Jones et al.: o backbone das proteínas é composto de estruturas repetidas (4 a 10 resíduos) • Dificuldade • Infinitas possibilidades de conformação entre dois fragmentos • Solução • Usar forte restrição na conformação

8. Bib. Fragmentos - Motivação • Breve histórico estrutural das proteínas: • Há quase 50 anos, as hélices  e fitas foram descritas por Corey & Pauling. • Dez anos mais tarde, os ângulos de torção  e , permitidos a cada resíduo na interação das ramificações laterais com a cadeia principal, foram definidos por Ramachandran • Em 1986 - Jones & Thirup detectam que quase todas as regiões do backbone da proteína são formadas por estruturas canônicas repetidas. • Posteriormente, Unger et al. classificaram as unidades peptídicas, formadas de 4 a 10 resíduos, da cadeia principal das proteínas numa coleção de fragmentos. Nível intermediário de representação das estruturas das proteínas (entre a estrutura primária e a secundária).

9. Bib. Fragmentos - Motivação • Mesmo utilizando os ângulos de torção para restringir o grau de liberdade, a cadeia de uma proteína pode ter um número infinito de diferentes conformações. • Restringir a conformação local dos resíduos para um número limitado de estados pode ajudar na discretização da conformação da proteína, reduzindo o número de possíveis arranjos espaciais. • Logicamente, a utilidade deste tipo de modelo depende da exatidão com que ele modela a conformação real da proteína bem como sua complexidade, o número de possíveis estados de cada resíduo.

10. Bib. Fragmentos – Princípio • Encontrar um conjunto finito de fragmentos de proteínas que possam ser utilizados para aproximar a conformação espacial de qualquer proteína com boa precisão.

11. Bib. Fragmentos – Etapas • I – Conjunto de Treinamento • II – Construção das Bibliotecas • III – Modelagem do Alvo • IV – Validação do Modelo

12. Bib. Fragmentos – Etapa I • Conjunto de Treinamento • Seleção das proteínas que darão origem às bibliotecas • Fragmentação com escolha do comprimento dos fragmentos

13. Bib. Fragmentos – Etapa II • Construção das Bibliotecas • Agrupamento dos fragmentos mais representativos através de clustering • Escolha de uma das técnicas existentes • Uso de uma métrica de comparação entre fragmentos

14. Bib. Fragmentos – Etapa III • Modelagem do Alvo • A partir de uma biblioteca, modela-se a estrutura da proteína-alvo, semelhante à montagem de um quebra-cabeças • Aplicação de restrições

15. Bib. Fragmentos – Etapa IV • Validação do Modelo • Comparação com o modelo real (testes) • Uso de softwares específicos

16. Bib. Fragmentos – Est. Caso • Estudo exaustivo com bibliotecas de fragmentos de comprimento variando de 4 a 7 resíduos. (Cientistas da Univ. de Stanford) • A exatidão das representações discretas depende da sua complexidade e varia de 1.9Å para um modelo de 4 estados e fragmentos de tamanho 7 até 0.76Å para um modelo de 15 estados e fragmentos de tamanho 5.

17. Bib. Fragmentos – Est. Caso • Para a fase inicial de clustering um conjunto de proteínas do PDB, com os dados estruturais mais confiáveis, serviu como conjunto de dados inicial (tabela 1). • Deste conjunto de proteínas foram extraídos quatro conjuntos de treinamento de fragmentos de backbone de proteínas. Estes conjuntos de treinamento diferiam no comprimento dos fragmentos que variava de 4 a 7 resíduos. O número de fragmentos em cada conjunto foi 8949, 7123, 5910, 5029 para comprimentos de 4, 5, 6 e 7 resíduos, respectivamente.

18. Bib. Fragmentos – Est. Caso • Antes da aplicação da técnica de clustering duas observações a respeito dos dados do conjunto de testes precisam ser ressaltadas: os fragmentos considerados fora do padrão e a grande quantidade de fragmentos hélice . • Os primeiros são aqueles cujo desvio cRMS em relação a todos os outros é relativamente alto. De acordo com um limiar, estes fragmentos são removidos. Cerca de 10% são descartados com os seguintes valores de limiar: 0.074Å, 0.307Å, 0.487Å e 0.755Å, para conjuntos de de comprimento 4, 5, 6 e 7 resíduos, respectivamente. • A grande quantidade de fragmentos contendo hélices  dificulta a rotina de clustering.

19. Bib. Fragmentos – Est. Caso • A similaridade estrutural entre dois fragmentos é medida através do desvio cRMS entre os átomos Cα, após superposições usando mínimos quadrados.

20. Bib. Fragmentos – Est. Caso • Técnica de clustering:Simulated annealing k-means. • Indicado para vários problemas de clustering utilizando dados biológicos com distribuição desconhecida e desigual dos objetos. • derivada da k-means pelo melhoramento do conjunto de centroids. • O k-means clustering é executado repetidas vezes mesclando dois conjuntos e dividindo outro. • Os conjuntos a serem mesclados são selecionados aleatoriamente, sendo que os conjuntos mais próximos têm maiores chances de ser selecionados. • O conjunto a ser dividido também é selecionado aleatoriamente, sendo que conjuntos dispersos têm mais chances de ser escolhidos.

21. Bib. Fragmentos – Est. Caso • Várias funções diferentes foram testadas na atribuição de uma pontuação a cada conjunto e a escolhida (melhores resultados) foi a variância total do conjunto (soma de todos os quadrados das distâncias dos fragmentos em relação ao elemento principal do conjunto - centroid). • O número de conjuntos desejado é um parâmetro para a rotina de clustering. • O método utilizado é melhor que o seu antecessor pois lida melhor com altas concentrações de fragmentos (grande quantidade de hélices ) e por ser indiferente à escolha inicial dos elementos centrais dos conjuntos.

22. Bib. Fragmentos – Est. Caso • Esta técnica é ainda um pouco melhor que o método de clustering hierárquico (cujo tempo de execução é muito maior) que mescla os conjuntos em baseando-se na distância máxima entre quaisquer dois membros de conjuntos diferentes. • O resultado da aplicação da técnica de clustering é compilado em bibliotecas, pequenos conjuntos de fragmentos representativos de proteínas. As bibliotecas são representações dos conjuntos e são constituídas pelos elementos centrais dos mesmos (o fragmento com a mínima soma dos desvios cRMS relativo a todos os outros fragmentos do conjunto).

23. Bib. Fragmentos – Est. Caso • Muitas execuções da rotina de clustering são realizadas (variando o número de conjuntos e o comprimento dos fragmentos). Cada execução inicia-se com 50 diferentes elementos centrais (sementes) aleatórias e, ao final, escolhe a melhor biblioteca com a mínima pontuação de variância total. • Como os fragmentos agrupados são utilizados para construir bibliotecas representativas de todos os fragmentos do conjunto de treinamento, é esperado que resultem em boas bibliotecas, representando também todos os motifs encontrados nas proteínas reais. Para mensurar a qualidade de uma biblioteca são usados o local e o global fits (ajustes), obtidos a partir da aproximação da estrutura das proteínas do conjunto de testes (independente do conjunto de treinamento).

24. Bib. Fragmentos – Est. Caso • Local-fit: medida de quão bem a biblioteca modela a conformação local de todas as proteínas no conjunto de testes. • Cada proteína é desmembrada num conjunto de fragmentos de tamanho específico f. Cada fragmento da proteína é associado a um fragmento da biblioteca que contenha o melhor valor do cRMS. • O local-fit é a média dos valores dos cRMS de todos os fragmentos aproximados.

25. Bib. Fragmentos – Est. Caso • Global-fit, é a medida de quão bem uma biblioteca modela a conformação tridimensional global de todas as proteínas do conjunto de testes. • Uma forma de construir estruturas tridimensionais contíguas a partir das bibliotecas de fragmentos é concatenar os fragmentos de bibliotecas com melhores local-fit citados anteriormente. • Superpondo o primeiro átomo C de cada fragmento com o último átomo C  do fragmento anterior, torna-se necessário especificar a orientação dos dois fragmentos. Isso pode ser feito pela especificação os ângulos de torção  e . • Porém, em muitos casos, estes ângulos podem assumir uma grande combinação de valores.

26. Bib. Fragmentos – Est. Caso • A solução encontrada foi utilizar o chamado global-fit aproximado, onde a posição de um fragmento é determinada pela superposição dos seus três primeiros C com os três últimos do fragmento anterior (Exemplo 2-D na figura 6). • Esta abordagem discretiza o espaço de todas as aproximações construindo uma relação de um para um entre uma sequência de fragmentos e sua representação tridimensional. • Enquanto o melhor local-fit pode ser facilmente calculado, a sequência de fragmentos de biblioteca necessários para o global-fit é muito mais difícil de encontrar. • A sequência ótima de fragmentos de biblioteca deve definir a estrutura 3-D com o mínimo desvio cRMS em relação à estrutura real da proteína alvo.

27. Bib. Fragmentos – Est. Caso • Conjunto de teste de proteínas utilizado por Park & Levitt. Inclui 145 proteínas com diferentes estruturas de motifs, de comprimentos variáveis entre 36 e 753 resíduos. (Tabela 1, identificadores do PDB das 145 proteínas). • Facilidade na comparação e extensão dos resultados obtidos em relação aos dois autores citados.

28. Bib. Fragmentos – Est. Caso • Tabela 2 mostra os melhores valores do local-fit. • A figura 1 mostra os dados da tabela 2 em função da complexidade das bibliotecas. Os fragmentos das proteínas do conjunto de teste podem ser descritos satisfatoriamente por qualquer das bibliotecas consideradas (desvio abaixo de 1Å em todos os casos). • Para bibliotecas cujos fragmentos têm o mesmo tamanho, a exatidão do local-fit aumenta junto com a complexidade. • Para bibliotecas que possuem a mesma complexidade, a exatidão do local-fit aumenta com a diminuição do número de resíduos dos fragmentos (Menor número de átomos C).

29. Bib. Fragmentos – Est. Caso • Tabela 2 mostra também os valores do global-fit. • A figura 2 mostra os dados da tabela 2 em função da complexidade das bibliotecas. A média do global-fit no conjunto de testes varia de 2.58 Å, para a complexidade mais baixa, até 0.76 Å para a biblioteca de complexidade mais alta. • Para fragmentos que têm o mesmo tamanho, bibliotecas mais complexas oferecem uma melhor aproximação pelo global-fit. • Para uma mesma complexidade, bibliotecas cujos fragmentos têm maior comprimento resultam numa melhor aproximação do global-fit.

30. Bib. Fragmentos – Est. Caso • Figura 4 mostra a média do desvio cRMS das aproximações local-fit versus a mesma medida das aproximações global-fit. • O local-fit é sempre menor que o cRMS global-fit correspondente. Isto já era esperado, pois o local-fit ignora a ligação entre fragmentos adjacentes ao longo da cadeia. • Desta forma, pode-se utilizar o local-fit na estimativa do global-fit. É possível perceber também que, para um mesmo nível de global-fit, o local-fit decresce com o comprimento do fragmento.

31. Bib. Fragmentos – Est. Caso • A dependência da exatidão das aproximações em relação ao comprimento das proteínas aproximadas. • Foram considerados os desvios cRMS da melhor aproximação local-fit e da melhor aproximação global-fitversus o comprimento do polipeptídio. • A exatidão da aproximação local-fit é independente do comprimento da cadeia. • Já as aproximações global-fit são ligeiramente dependentes do comprimento da cadeia (os dados não foram exibidos). • Exemplo de aproximações na figura 5.

32. Bib. Fragmentos – Est. Caso • Nas aproximações feitas com as bibliotecas de fragmentos o global-fit varia de 2.9 Ǻ até 0.76 Ǻ com complexidades de 2.66 a 15 estados por resíduo, respectivamente. • Os modelos resultantes da aproximação da estrutura das proteínas utilizando tais bibliotecas são úteis para: • predição de estruturas, • ajustes de loops, • enumeração exaustiva de conformações de peptídeos e • determinação de estrutura de baixa resolução através de ressonância nuclear magnética (nuclear magnetic ressonance - NMR) ou critalografia de raio-X.

33. Bib. Fragmentos – Est. Caso • Resultados ainda melhores são esperados com a utilização de bibliotecas de fragmentos de tamanho 6 ou 7. • Porém, para construção de tais bibliotecas uma grande quantidade de dados de coordenadas de proteínas é necessário. Aqui, são utilizadas bibliotecas de 250 fragmentos de comprimento 7 que apresentam uma complexidade de 1.91 Å. Para atingir 1 Å seria necessário uma complexidade em torno de 8 e 84 = 4096 fragmentos (futuro, com o crescimento na determinação das estruturas das proteínas).

34. Proposta de Trabalho • Construir e analisar diferentes tipos de bibliotecas de fragmentos • Objetivo principal: • Determinar parâmetros ideais para aproximação de estruturas de proteínas • Variações serem testadas • Métrica de similaridade • Técnicas de clustering • Comprimento dos resíduos • Tamanho das bibliotecas

35. Conclusões • Técnicas computacionais x Distância entre seqüências e estruturas 3-D • Uso de bibliotecas de fragmentos • técnica mais rápida e tão precisa quanto a modelagem comparativa • Proposta • Necessidade de aprofundamento e estabelecimento de parâmetros ideais na aplicação da nova técnica

36. Referências • HOLMES, J. Bradley and TSAI, Jerry. Protein Science. 2004, 13, P. 1636-1650. • KOLODNY, Rachel; KOEHL, Patrice; GUIBAS, Leonidas and LEVITT, Michael. Journal of Molecular Biology. 2002, 323, P. 297-307.

37. Bibliotecas de Fragmentos para Inferência de Estruturas de Proteínas Tiago Edmundo Ribeiro Brito <terb@cin.ufpe.br>

38. Voltar

39. Voltar

40. Voltar

41. Voltar

42. Voltar

43. Voltar

44. Voltar