La plate-forme Protéomique Génopole Toulouse Midi-Pyrénées

1. La plate-forme Protéomique Génopole Toulouse Midi-Pyrénées Bernard Monsarrat – IPBS/CNRS http://proteomique.ipbs.fr http://www.genotoul.fr RIO

2. Proteomics Platform Toulouse Midi-Pyrénées RIO Label From proteins to function …… BioinformaticsSQL-LIMSMascotIn-house software Technical Skills Biomolecular Interactions Biacore 3000, X 2D Gel Electrophoresis ScannersTyphoon Quantitative Proteomics ABI Q-STAR http://proteomique.ipbs.fr RobotizationPackard Multiprobe II Posttranlational ModificationsABI Q-TRAP Peptide SequencingProtein CharacterizationThermoFisher Orbitrap Peptide Mass Fingerprinting ABI MALDI Tof-Tof

3. IFR 30 La Plateforme Génopole Toulouse Midi-Pyrénées ICR IFR 31 IFR 109 IPBS IFR 40

4. The Proteomics Platform - Staff • Renaud Albigot - Bioinformatics • David Bouyssié - PhD in Bioinformatics • Emmanuelle Mouton - Bioinformatics • Karima Chaoui - Biochemistry and Mass Spectrometry • Florence Dalvai - Biochemistry and Mass Spectrometry • Carine Froment - Biochemistry and Mass Spectrometry • Carole Pichereaux - Biochemistry and Mass Spectrometry • Michel Rossignol - Biochemistry and Mass Spectrometry • Alexandre Stella - Biochemistry and Mass Spectrometry • Ludovic Canelle - Post-doc, • Marie-Pierre Bousquet - Researcher • Anne Gonzalez de Peredo – Researcher • Bernard Monsarrat Coordination • Mariette Matondo - PhD student • Odile Schiltz – Researcher • Sandrine Uttenweiler – Researcher • J.P. Estève and F. Lopez (IFR 31), F. Pont (IFR 30), P. Valenti (IFR 109), A. Cuider (ICR)

5. Challenges in Proteomics Patterson, S.D. & Aebersold, R.H (2003) Nature Genetics Interacting Proteins Post-Translational Modifications Differential Proteomics

6. 2006-2007 • Mise en place d’une nouvelle génération d’instruments : - LTQ-FT-Orbitrap • Développement de nouvelles stratégies : • - Identification de protéines de faible abondance

7. Un spectromètre de masse hybride de nouvelle génération : LTQ-FT-Orbitrap • Mass resolution > 60,000 (FWHM) at m/z 400 at 1 sec cycle • Max. resolution > 100,000 at m/z 400 in a full scan • Mass accuracy < 5 ppm external calibration (2 days old) • < 2 ppm internal calibration (lock mass) • Mass range : 50 – 2,000; 200 – 4,000 • Sensitivity : sub-femtomol on column • Dynamic range : 3000 in a single scan • Throughput : 3 accurate mass scans per second or 4 scans per second parallel detection (1 HR Orbitrap scan + 3 LR LTQ MS/MS scans) IPBS Toulouse : Inst 15/09, Recept. 20/10 -2006

8. Mouvement des ions dans l’Orbitrap “ comment maintenir des ions stables, dans un champ électrostatique” Dr. Alexander Makarov,

9. Paramètres affectant le degré de couverture d’un protéome 100mg total protein lysate ↔100 copy/cell ↔ 20 fmol de Godoy et al. Genome Biol. 2006 Eucaryotic cells : ~105 -106 Biological fluids : ~ 1010 (serum) Red blood cell : 97-98% haemoglobin 2% other proteins Low abundance peptides not picked for MS/MS: 60% Trap filled with 5.106 ions Detection of signal ~ 500 ions Dynamic range ~ 104 Reduction de la gamme dynamique ?

10. ETUDE DU «PROTEOME CACHE» DE L’ERYTHROCYTE PAR LIGANDS PEPTIDIQUES COMBINATOIRES ET LC-MS/MS SUR LTQ-FT-ORBITRAP « Equalization des érythrocytes » Echantillon protéique Large gamme dynamique RBC : 98% d’hémoglobine Eluat : Réduction de la gamme dynamique 64 millions de ligands peptidiques Flow-Through : Majeure partie des protéines de haute abondance Collaboration : E. Boschetti (R&D), BioRad

11. Mq Start FT E1 S1 E2 S2 E3 S3 250 kDa 150 kDa 100 kDa 75 kDa 50 kDa 37 kDa 25 kDa 20 kDa 15 kDa 10 kDa « Equalization des érythrocytes » SE-Beads E-Beads E-Beads SE-Beads RBC lysat fractionSoluble -COOH -NH2 Elution TUC Elution TUC Organic elution Start Organic elution FT Elution UH Elution UH E1 E3 S1 S3 E2 S2 SDS-PAGE analytique

12. « Equalization des érythrocytes » Start E1+E2+E3+S1+S2+S3 N° spots: 80 (1300 g) Silver staining N° spots: 950 (640 g) Silver staining

13. Analyse par nanoLC-MSMS LTQ-FT-Orbitrap Start : 2mg E1 : 100µg E2 : 100µg E3 : 100µg S1 : 100µg S2 : 100µg S3 : total SDS-PAGE gel Cut 20 bands per sample Trypsin digestion NanoLC-MSMS on LTQ-Orbitrap 1 MS Orbitrap reso=60000 5 MSMS Ion trap (Data Depedent Acquisition) MFPaQ : Protein Validation False Postive Rate: 0.7% Mascot 2.0 : Search in IPI human MFPaQ : Bouyssié et al. Mol. Cell. Prot., 2007 Effet de l’”Equalization” sur MS/MS des peptides ?

14. Effect of equalization on high abundance proteins Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Before equalization After equalization Number of identified peptides decreases after equalization More time for minor peptides sequencing

15. Effect of equalization on low abundance proteins Hepatoma-derived growth factor Before equalization After equalization Number of identified peptides increases after equalization + sequencing of additional proteins

16. 60 480 1107 Avant versus Après « Equalization » Après Equalization E1+E2+E3+S1+S2+S3 fractions 1587 proteins Avant Equalization « Start » fraction 540 proteins NanoLC-MSMS on LTQ-Orbitrap Identifications : 1647 proteines ! Pasini et al MCP 2006 : 252

17. Evolution des approches protéomiques  Analyse systématique : Identification de l'ensemble des protéines d'un système  Analyse fonctionnelle : • Interactions protéine/protéine : Caractérisation des partenaires protéiques au sein d’un complexe • Modifications post-traductionnelles • Analyse différentielle : (Bioinformatique) Quantification relative d'un ensemble de protéines dans deux conditions distinctes  Analyse fonctionnelleciblée : (Bioinformatique) • Etude différentielle de sous-protéomes • Quantification absolue de protéines d’intérêt

18. Remerciements • Réseau National des Génopoles • CNRS, • Région Midi-Pyrénées • Pôle de Compétitivité Cancer Bio Santé • Cancéropole GSO, INCa • FRM, ANR… CPER 2007_2013, Protéomique : 5.2 M€