第十章 DNA 的生物合成 ( Biosynthesis of DNA)

1. 第十章 DNA的生物合成 (Biosynthesis of DNA) 第一节 DNA复制的特点 第二节 DNA复制的条件 第三节 DNA生物合成过程 第四节 DNA的损伤与修复 第五节 反转录作用

2. DNA是由四种脱氧核糖核酸所组成的长链大分子，是遗传信息的携带者。生物体的遗传信息就贮存在DNA的四种脱氧核糖核酸的排列顺序中。DNA是由四种脱氧核糖核酸所组成的长链大分子，是遗传信息的携带者。生物体的遗传信息就贮存在DNA的四种脱氧核糖核酸的排列顺序中。 • DNA的复制:指以原来DNA分子为模板合成出相同分子的过程。DNA通过复制将遗传信息由亲代传递给子代；通过转录和翻译，将遗传信息传递给蛋白质分子，从而决定生物的表现型。 • DNA复制时每个子代DNA分子的一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种复制方式称半保留复制。 • 意义：半保留复制说明DNA在代谢上的稳定性。经过许多代的复制，DNA链仍可保持完整，这在生物的遗传上是十分重要的。 • DNA的复制、转录和翻译过程就构成了遗传学的中心法则。

3. DNA dependent DNA polymerase——DDDP DNA dependent RNA polymerase——DDRP RNA dependent RNA polymerase——RDRP RNA dependent DNA polymerase——RDDP

4. 在RNA病毒中，其遗传信息贮存在RNA 分子中。因此，在这些生物体中，遗传信息 的流向是RNA通过复制，将遗传信息由亲代 传递给子代，通过反转录将遗传信息传递给 DNA，再由DNA通过转录和翻译传递给蛋白 质，这种遗传信息的流向就称为反中心法 则。

5. 第一节 DNA复制的特点 一、半保留复制 DNA在复制时，以亲代DNA的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链，这种现象称为DNA的半保留复制(semi-conservative replication)。

6. DNA以半保留方式进行复制，是在1958年由 M. Meselson 和F. Stahl 所完成的实验所证 明。该实验首先将大肠杆菌在含15N的培养基中 培养约十五代，使其DNA中的碱基氮均转变为 15N。将大肠杆菌移至只含14N的培养基中同步 培养一代、二代、三代。分别提取DNA，作 CsCl密度梯度离心，可得到下列结果：

8. 二、有一定的复制起始点、复制子和方向 （1）复制起始点(Ori C) DNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段，即复制起始点。 细菌的Ori C结构特点： 串联重复序列(tandem repeat):A-T 回文结构(palindrome) A--TA--GTGT DnaA AATAGGT--T 在原核生物中，复制起始点通常为一个，而在真核生物中则为多个。最早研究DNA复制起点和方向的是J.Cairns（1963年）。

9. Replication Fork DNA复制时，局部双螺旋解开形成两条单链，这种叉状结构称为复制叉。

10. （2）复制子 　　　基因组能独立进行复制的功能单位称为复制子 (replicon)，每个复制子都含有控制复制起始的起点 (origin)，可能还有终止复制的终点(terminus)。每个起 始点产生两个移动方向相反的复制叉，复制完成时，复 制叉相遇并汇合连接。习惯上把两个相邻起始点之间的 距离定为一个复制子。

11. （3）复制方向 DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行复制. 但在低等生物中,也可进行单向复制（如滚环复制） ①. 原核细胞：染色体和质粒 固定起点 真核细胞：细胞器DNA 双向复制， 环状DNA复制形成θ形结构。 ②.真核生物：染色体DNA，复制时多个起始点。

13. θ型

14. 单向复制 i 双向复制 观察到的放射自显影图象

15. 5′ 单链环状DNA主要采用滚环式复制 3′ 5′ 3′ 5′ ① 滚环式复制是某些低等生物的复制形式． ② 在入侵细胞后，病毒在胞内的繁殖方式（复制型）为双链DNA，环状双链DNA受有核酸内切酶活性的A蛋白作用，在复制起始点打开一个缺口，形成有3，－OH和5，-P的开环单链． ③ 复制不需引物而在开链的3，-OH延伸，保持闭环的对应单链为模版，一边滚动一边进行连续的复制． ④ 滚动的同时，外环5，端逐渐离环向外伸出．完成一次复制后，A蛋白把母链和子链切断，外环母链再重新滚动一次，3，端沿母链延长，最后合成两个子双环．

16. D环复制 ① D环复制是线粒体DNA（mtDNA）的复制形式． ② 复制时需要合成引物． ③ mtDNA为双链，第一个引物以内环模板延伸． ④ 至第二个复制起始点时，又合成另一个反向引物，以外环为模板进行反向的延伸． ⑤复制中呈字母D形状而得名． ⑥ D环复制的特点：复制起始点不在双链DNA同一位点，内、外环复制时序有差异． ⑦真核生物的DNA-pol γ是线粒体催化DNA复制的DNA聚合酶． ⑧ mtDNA容易发生突变，损伤后的修复又较困难．

18. 真核生物DNA的多起点复制

19. 三、需要引物 参与DNA复制的DNA聚合酶，必须以一段具有3’端自由羟基（3’-OH）的RNA作为引物(primer) ，才能开始聚合子代DNA链。 RNA引物的大小，在原核生物中通常为50～100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。 四、双向复制 DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行复制。但在低等生物中，也可进行单向复制（如滚环复制）。

20. 五、半不连续复制 （semidiscontinuous replication） 由于DNA聚合酶只能以5’→3’方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的 方向必须为3’→5’。因此，分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链 时的方式是不同的。 定义：在DNA复制过程中，亲代DNA分子中以3’→5’方向的母链作为模板指 导新的链以5’→3’方向连续合成;另一股以5’→3’ 为方向的母链则指 导新合成的链以 5’→3’方向合成1000—2000个核苷酸长度的许多不连续 的片段（岗崎片段）。这种复制方式称之为半不连续复制。

21. OH PPP OH PPP OH + P OH PPP OH + PPP DNA合成方向不可能是3′→5′的解释

22. 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 前导链 半不连续复制 5’ 5’ 3’ 5’ 岗崎片段 3’ 3’ 随从链 5’ 以3'→5'方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为5'→3'，这一条链被称为领头链(leading strand)。而以5'→3'方向的亲代DNA链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是5'→3'，这条链被称为随从链(lagging strand)。

23. 前导链：在引物的3’端按5’→3’方向连续不断地合成的DNA链。前导链：在引物的3’端按5’→3’方向连续不断地合成的DNA链。 随从链：在引物的3’端按5’→3’方向不连续合成的DNA链。 冈崎片段：随从链上不连续合成的DNA短片段（不包括引物） 由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因此，随从链的合成是一段一段的。DNA在复制时，由随从链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazaki fragment)。 冈崎片段的大小，在原核生物中约为1000～2000个核苷酸，而在真核生物中约为100个核苷酸。

24. 第二节 DNA复制的条件 一、底物 以四种脱氧核糖核酸(deoxynucleotide triphosphate)为底物，即dATP，dGTP，dCTP，dTTP。 二、模板(template) DNA复制是模板依赖性的，必须要以亲代DNA链作为模板。亲代DNA的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。

25. 三、引物酶(primase)、引发体(primosome)、引 发前体和RNA引物 DNA聚合酶只能在引物的3’-末端起始DNA链合成，合成 这些引物的酶统称为引物酶。 引发体(primosome): 引发体由引物酶（primase）与引发前体组装而成的复合 物，催化引物RNA的合成。由引发前体六种蛋白（dnaB, dnaC, I, n, n’, n”）组成。

26. 引物酶本质：DDRP Ecoli：60kD，DnaG 编码） • 引发体(primosome) 引物酶 引发前体 • i、n、n”、dnaC • n’、dnaB 5´ 3 DnaC 5´ 3´ Helicase(DnaB) primosome 5´ 3´ 3´ 5´ 5´ primase 5´ RNA primer DnaA

27. 引发前体是由若干蛋白因子聚合而成的复合体。在原核生物引发前体是由若干蛋白因子聚合而成的复合体。在原核生物 中，引发前体至少由六种蛋白因子构成。蛋白i(DnaT)、蛋白 n(PriA)、蛋白n”(PriC)、蛋白dnaC与引物预合成有关，蛋白 n’(PriB)与蛋白dnaB与识别复制起始点有关，并具有 ATPase活性。 引物酶本质上是一种依赖DNA的RNA聚合酶(DDRP)，该 酶以DNA为模板，聚合一段RNA短链引物(primer)，以提供 自由的3'-OH，使子代DNA链能够开始聚合。

29. 四、DNA聚合酶 (DDDP) (一)共同性质 • 以dNTP为前体催化合成DNA • 需要模板和引物的存在 • 不能起始合成新的DNA链 • 催化dNTP加到生长中的DNA链的3’-OH末端 • 催化DNA合成的方向是5’→3’

30. （二）种类和生理功能 1.原核生物的DNA聚合酶 在原核生物中，目前发现的DNA聚合酶有三种，分别命名为 DNA聚合酶Ⅰ(polⅠ)，DNA聚合酶Ⅱ(polⅡ)，DNA聚合酶 Ⅲ(pol Ⅲ)，这三种酶都属于具有多种酶活性的多功能酶。参与 DNA复制的主要是polⅠ和pol Ⅲ。 polⅠ为单一肽链的大分子蛋白质，可被特异的蛋白酶水解为 两个片段，其中的大片段称为Klenow fragment，具有5’→3’ 聚合酶活性和3’→5’外切酶的活性。

32. (1) DNA聚合酶Ⅰ（DNA PolymeraseⅠ） • Kornberg酶（1956年） • 100个酶分子/每个细胞 • 单链多肽（109kD） • 大小二个片段 （枯草杆菌蛋白酶处理） 切除RNA引物 损伤修复 校读功能 聚合功能 3’ 5’ 5’ 3’ 外切酶 聚合酶 5’ 3’ 外切酶 N C 小片段 大片段（ klenow片段） （常用的工具酶） 34kD 76kD

33. 5’-3’聚合酶活性 • 模板 • 引物-3’-OH

34. 3’-5’外切酶活性 切除错配核苷酸 错配硷基 正确 核苷酸 聚合酶 复制方向 3´ 5´ 3´ 5´ 3´ 5´ DNA聚合酶的校对功能

35. 5'→3'外切酶活性

36. 从5’-P端依次切除，可连续切除 • 只切配对的5’-P末端核苷酸 • 既可切除脱氧核苷酸也可切除核苷酸

37. (2)大肠杆菌DNA聚合酶Ⅱ(DNA polⅡ) • MW为120KD • 100个酶分子/每个细胞 • 聚合作用:只有DNA polⅠ的5% • 3’→5’外切酶活性 • 无5’→3’外切酶活性。 • 对作用底物的选择性较强， • 不是复制的主要聚合酶

38. (3)pol Ⅲ: 由十种共22个亚基组成 • α亚基具有5’→3’聚合DNA的酶活性 • ε亚基具有3’→5’外切酶的活性 • θ亚基具有促进ε亚基外切酶的活性

39. 大肠杆菌三种DNA聚合酶特性比较 DNA 聚合酶Ⅰ DNA 聚合酶Ⅱ DNA聚合酶Ⅲ （复合物） 比较项目 109，000 400 + + + 1 去除引物 填补缺口 修复损伤 校正错误 400，000 10-20 + + + 50 DNA复制 校正错误 分子量 每个细胞的分子统计数 5’-3 ’聚合酶作用 3’-5’核酸外切酶作用 5’-3’核酸外切酶作用 转化率 生理功能 120，000 100 + + - 0 .05 未知

40. 2. 真核细胞的DNA聚合酶 • 参与随从链的合成 • 参与前导链的合成 • 参与线粒体DNA的合成 • 参与DNA的修复 • 五种 • DNA聚合酶α • DNA聚合酶δ和PCNA • DNA聚合酶γ • DNA聚合酶β、ε

41. 真核细胞几种主要DNA聚合酶的性质 DNA聚合酶α β γ δ ε 蛋白质分子量（KD） > 250 36-38 160-300 170 256 细胞定位 核 核 线粒体 核 核 5’ →3’聚合酶 有 有 有 有 有 3’ →5’外切酶 无 无 有 有 有 引物酶 有 无 无 无 无

42. 五、DNA连接酶 DNA连接酶(DNA ligase)可催化两段DNA片段之间磷酸二 酯键的形成，而使两段DNA连接起来。 DNA连接酶

43. DNA连接酶催化的条件是： ①需一段DNA片段具有3'-OH，而另一段DNA片段具有5'-Pi基； ②未封闭的缺口位于双链DNA中，即其中有一条链是完整的； ③需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由 ATP供能。

44. 六、解螺旋酶(unwinding enzyme/ helicase/ rep蛋白） 解螺旋酶（unwinding enzyme），又称DNA解链酶(DNA helicase)或 rep蛋白，是用于解开DNA双链的酶蛋白。通过水解ATP获得能量，来打开DNA 双链，DNA双螺旋解开形成单链，暴露出碱基，便于复制，每解开一对碱基， 需消耗两分子ATP。 目前发现存在至少存在两种解螺旋酶。

45. 七、单链DNA结合蛋白 单链DNA结合蛋白（single strand binding protein, SSB）又称螺旋反稳蛋白（HDP）。这是一些能够与单链DNA结合的蛋白质因子。其作用为： ①使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，即稳定单链DNA，便于以其为模板复制子代DNA； ②保护单链DNA，避免核酸酶的降解。

46. 八、拓扑异构酶(topoisomerase) 拓扑异构酶Ⅰ可使DNA双链中的一条链切断，松开双螺旋后再将DNA链连接起来，从而避免出现链的缠绕。 拓扑异构酶Ⅱ可切断DNA双链，使DNA的超螺旋松解后，再将其连接起来。 大肠杆菌拓朴异构酶Ⅰ的结构

47. 第三节 DNA生物合成过程 基本步骤： 1、双链的解开（起始） 2、引发：RNA引物的合成 3、DNA链的延长 4、切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段 5、切除和修复掺入DNA链的dUMP和错配碱基。

48. 一、复制的起始 复制起点上四个9bp重复序列为DnaA蛋白的结合位点，大约20-40个DnaA蛋 白各带一个ATP结合在起点位点上，并聚集在一起，DNA缠绕其上，形成起始复 合物．Hu蛋白是细胞的类组蛋白质，可与DNA结合，使双链DNA弯曲．受其影 响，邻近三个成串富含AT的13bp序列被变性，成为开链复合物，所需能量由ATP 提供．DnaB六聚体随即在DnaC帮助下结合于解链区．DnaB借助水解ATP产生的 能量，沿DNA链5’-3’方向移动，解开DNA双链，此时称为前引发复合物． DNA 双链的解开还需要DNA旋转酶（拓扑异构酶Ⅱ）和SSB.至此，即可由引物合 成酶(DnaG)合成RNA引物并开始DNA的复制．

49. 复制的起始，要求DNA呈负超螺旋，并且起点附近的基因处于转录状态．复制的起始，要求DNA呈负超螺旋，并且起点附近的基因处于转录状态． RNA聚合酶对复制起始的作用，可能是因为其在起始点附近合成一段RNA，形成RNA突环，影响起点的结构，因而有利于DnaA的作用．