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Mini-Revisão. Mini-Revisão. Começando a decifrar. Ciclo Lítico do Fago l. Ciclo Lítico do Fago l. Ciclo Lítico do Fago l. O fenômeno de restrição-modificação. Infecções com bacteriófagos em diferentes cepas bacterianas produziam o fenômeno de restrição-modificação. Arber, 1962
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O fenômeno de restrição-modificação Infecções com bacteriófagos em diferentes cepas bacterianas produziam o fenômeno de restrição-modificação. Arber, 1962 Nathans & Smith, 1962
Nomenclatura das enzimas de restrição EcoRI Escherichia coli BamHIBacillus amyloliquefaciens RH BglIIBacillus globigii PvuIIProteus vulgaris HindIIIHaemophilus influenzae Rd HinfIHaemophilus influenzae Rf Sau3AStaphylococcus aureus AluIArthrobacter luteus TaqIThermus aquaticus HaeIIIHaemophilus aegyptius NotI Nocardia otitidis-caviarum
Hibridação Calor ou pH = desnaturação
Reassociação Temperatura e força iônica
Marcação da sonda Ou com Polinucleotídeo Quinase
Estringência • Reação de Hibridação e Lavagem: • especificidade da sonda • tamanho da sonda • temperatura (T’m) • força iônica Especificidade : identidade de seqüência Tamanho: fragmento/ oligonucleotídeo Temperatura: T’m - 25oC Força iônica: NaCl
Hibridação in situ Localização de mRNA de ciclina (uma proteína que incita a célula a se dividir) = azul escuro Em azul claro os núcleos corados com DAPI
O que fazer com o fragmento? Clonagem de DNA A clonagem permite a eternizar o fragmento Um pedaço de DNA de um eucarioto poderia ser produzido por um procarioto.
Vetores de clonagem O que deve ter uma molécula para ser um veículo de clonagem? 1. Replicação autônoma 2. Marcas de seleção 3. Sítio para clonagem
Sítio de clonagem O sítio de restrição deve estar nas duas moléculas a serem ligadas. Após a clivagem, as extremidades são recombinadas e a enzima LIGASE refaz a ligação fosfodiester.
Transformação Hospedeiro: E.coli fenótipo e genótipo seleção, contenção, multiplicação
Outro vetor? Bacteriófagos e, mais recentemente, cosmídios são utilizados como vetores de clonagem, principalmente quando se deseja inserir um fragmento de DNA com tamanho de ~40 kb. YACs - fragmentos maiores ainda.
Seqüenciamento de DNA Princípios
Reação em cadeia de polimerização 1. Replicação
PCR 2. Amplificação
PCR - ANIMAÇÃO Um momento, por favor, estou carregando o programa.