Presentación Seminario I (BIOL 6971)

1. Presentación Seminario I (BIOL 6971) Iván Ferrer Rodríguez, Ph.D. Catedrático

2. Artículo a presentar Chloroquine Mediated Modulation of Anopheles gambiae Gene Expression. Patrícia Abrantes1, George Dimopoulos2, Ana Rita Grosso3,4, Virgílio E. do Rosário1, Henrique Silveira1. PLoS ONE.July 2008 | Volume 3 | Issue 7 | e2587. 1 Centro de Malária e OutrasDoençasTropicais- LA/ UEI de Malária, Instituto de Higiene e Medicina Tropical, Universidade Nova de Lisboa, Lisboa, Portugal. 2 W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University, Baltimore, Maryland, United States of America. 3Instituto de Medicina Molecular, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, Lisboa, Portugal. 4 University of Cambridge, Department of Oncology, Hutchison-MRC Research Centre, Cambridge, United Kingdom.

3. Puntos a discutir • Preámbulo al artículo • Introducción • Objetivos • Métodos • Resultados • Resumen • Agradecimientos • Preguntas

4. Chloroquine Mediated Modulation of Anopheles gambiae Gene Expression. Preámbulo • Cloroquina es un medicamento que se usa para tratar la malaria: • En uso desde los años 40 • Efectiva contra todas las formas de la malaria • Pocos efectos secundarios • Bajo costo • Resistencia en P. falciparum y P. vivax

5. Chloroquine Mediated Modulation of Anopheles gambiae Gene Expression. Preámbulo • Malaria es una enfermedad causada por un protozoario parasítico, Plasmodium, que habita en los glóbulos rojos y que es transmitida por mosquitos. • Cuatro especies causan malaria en humanos: • P. falciparum • P. vivax • P. malariae • P. ovale

6. Chloroquine Mediated Modulation of Anopheles gambiae Gene Expression. Preámbulo • Anopheles gambiaeen el principal vector de la malaria en África. • Expresión de los genes es el proceso mediante el cual éstos son usados para generar proteínas: • Transcripción • Traducción • http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120090/bio44.swf • http://www.sumanasinc.com/scienceinfocus/sif_malaria.html

7. Chloroquine Mediated Modulation of Anopheles gambiae Gene Expression. Ciclo de vida (30 min) (weeks) Hypnozoites Clinical manifestations

8. Chloroquine Mediated Modulation of Anopheles gambiae Gene Expression. Enfermedades Infecciosas Mortales Top Deadly Diseases of the Developing World Reuters and World Health Organizations. See also Leading Causes of Mortality Throughout the World, p. 667.

9. Chloroquine Mediated Modulation of Anopheles gambiae Gene Expression. Principales causas de mortalidad en el mundo Top 20 Causes of Mortality Throughout the World Source: The World Health Report, 2003, The World Health Organization (WHO).

10. Chloroquine Mediated Modulation of Anopheles gambiae Gene Expression. Proyecciones de mortalidad al 2030 Mathers and Loncar, 2006 - PLoS Medicine November 2006 | Volume 3 | Issue 2011 11 | e442

11. Chloroquine Mediated Modulation of Anopheles gambiae Gene Expression. Prevalencia y Resistencia de la Malaria Legend:prevalence of malaria, chloroquine resistance, sulfadoxine-pyrimethamine resistanceand multi-drug resistance. Modified from The malaria network, 1998.

12. La Cloroquina Actúa Modulando la Expresión de Genes en Anopheles gambiae. Introducción del artículo • El desarrollo del Plasmodium en el mosquito incluye varios pasos críticos para que el parásito complete su ciclo y sea transmitido al huésped vertebrado. • El mosquito tiene barreras físicas y químicas que contribuyen a que se reduzca el número de parásitos: • Epitelio del intestino • Respuesta inmune • Hay factores externos que contribuyen a que aumente la infectividad del parásito: • Ingestión de una concentración baja de anticuerpos • Segunda alimentación • Presencia de cloroquina en la sangre

13. Chloroquine Mediated Modulation of Anopheles gambiae Gene Expression. Introducción • Ingestión de cloroquina al momento del mosquito alimentarse ha sido asociada a un aumento en la infectividad del parásito. • El aumento en infectividad NO se asocia a un aumento en el número de gametocitos. • En este estudio se usa Real Time PCR para para demostrar por primera vez que la cloroquina baja la expresión en el mosquito de: • Proteasas de serina relacionadas al sistema inmune. • Péptidos antimicrobiales.

14. Chloroquine Mediated Modulation of Anopheles gambiae Gene Expression. Introducción • También estudian el impacto de la cloroquina en aumentar la expresión de dos genes de P. yoelii durantela trasmisión del parásito. • La cloroquina ya no se usa para tratar infecciones con P. falciparum debido al fenómeno de resistencia a drogas en mucha regiones, sin embargo se usa para tratar las otras especies de Plasmodium. • Los marcadores de resistencia a cloroquina desaparecen cuando se descontinúa la terapia, por lo tanto, podría re-introducirse la droga para terapias en el futuro.

15. Chloroquine Mediated Modulation of Anopheles gambiae Gene Expression. Objetivos • Expandir el conocimiento actual del impacto que tiene la cloroquina en la expresión genética del mosquito haciendo un análisis de transcriptos a nivel del genoma. • Entender el nivel de interferencia que tiene la cloroquina con los mecanismos de defensa del mosquito para establecer estrategias de tratamiento en el futuro.

16. Chloroquine Mediated Modulation of Anopheles gambiae Gene Expression. Métodos • Material Biológico e Infecciones • Plataformas de DNA (Microarray) e Hibridación • Análisis de Datos de Microarray • Real Time PCR Cuantitativo

17. Chloroquine Mediated Modulation of Anopheles gambiae Gene Expression. Métodos Material Biológico e Infecciones: • Anopheles gambiae s.s. (cepa SUAKOKO) fueron cultivados a 25°C y 75% humedad con ciclos de 12 hrs de luz y oscuridad y mantenidos en una solución de glucosa al 10%. • Los mosquitos se alimentaron en ratones y se recolectaron 24 hrs después, cuando invaden los ooquinetos y generan una respuesta inmune robusta. • Se cortaron los intestinos de 50 mosquitos y se procesaron para preparar RNA.

18. Chloroquine Mediated Modulation of Anopheles gambiae Gene Expression. Métodos Material Biológico e Infecciones: • A los 5-6 días, los mosquitos se alimentaron en: • Ratones BALB/c infectados con P. berghei ANKA Clone 2.34 tratados con cloroquina 50 mg/kg 17 horas antes. • Ratones BALB/c no infectados tratados con cloroquina 50 mg/kg 17 horas antes. • Ratones BALB/c infectados con P. berghei sin tratar con cloroquina (control negativo). • Ratones BALB/c no infectados sin tratar con cloroquina (control negativo).

19. Métodos Plataformas de DNA (Microarray) e Hibridación: • Microarray de cDNA de Anopheles conteniendo 20,000 EST de varios tejidos y varios estadios de desarrollo se usaron para los análisis.

20. Métodos Plataformas de DNA (Microarray) e Hibridación: • El RNA de los grupos de 50 mosquitos se extrajo con TRIzon (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del manufacturero. • Para sintetizar el cDNA y amplificar el mRNA antisentido se uso MessageAmp aRNA kit (Ambon). • Sondas de cDNA se sintetizaron y marcaron con Cy3-dUTP Cy5-dUTP durante una reacción de transcriptasa reversa.

21. Chloroquine Mediated Modulation of Anopheles gambiae Gene Expression. Métodos Plataformas de DNA (Microarray) e Hibridación: • Muestras experimentales fueron marcadas con Cy5: • Ratones BALB/c infectados con P. berghei tratados con cloroquina. • Ratones BALB/c no infectados tratados con cloroquina. • Muestras control fueron marcadas con Cy3: • Ratones BALB/c infectados con P. berghei sin tratar con cloroquina (control negativo). • Ratones BALB/c no infectados sin tratar con cloroquina (control negativo).

22. Chloroquine Mediated Modulation of Anopheles gambiae Gene Expression. Métodos Plataformas de DNA (Microarray) e Hibridación: • Las sondas fueron suspendidas en amortiguador de hibridación y se pre-hibridizó a 42°C por 2 hrs. • Se hibridizó a 42°C toda la noche en una cámara de hibrización. • Se lavó dos veces en 2XSSC/SDS por 15 minutos y se secó. • Todos los experimentos se realizaron en duplicado.

23. Métodos Análisis de datos del Microarray: • Las laminillas fueron escaneadas usando un TECAN LS 300 Scanner (Tecan U.S., Inc., Durham, NC). • Las imágenes se analizaron con Chipskipper software version 1.1. • http://www.ansorgegroup.embl.de/chipskipper; accessed October 2004. • Las intensidades de las señales se estimaron, se eliminaron puntos con calidad pobre y se removieron la señales de trasfondo.

24. Chloroquine Mediated Modulation of Anopheles gambiae Gene Expression. Métodos Análisis de datos del Microarray: • Sólo los transcriptos que generaron resultados consistentes en los duplicados se consideraron. • Se identificaron los genes con cambios en expresión mayor a 1.5. • Se identificaron los ESTs y se les asignó una función usando: • AnoESTdatabase versio5 http://web.bioinformatics.ic.ac.uk:8080/AnoEST/anoest.php • Mosquito GenomeDatabase ENSEMBL v.36: Dec 2005 (http://www.ensembl.org/Anopheles_gambiae/index.html)

25. Chloroquine Mediated Modulation of Anopheles gambiae Gene Expression. Métodos Real Time PCR Cuantitativo: • Se usó el mismo RNA usado para los Microarray. • El RNA se trató con DNAse I y se transcribió al reverso usando M-MLV-RT (Invitrogen) en la presencia de un primer Oligo(dt)15 (Roche). • Se usaron 5 genes para validar los datos de expresión, incluyendo: • Dos genes del sistema inmune. • Dos genes relacionados a estrés oxidativo. • Un gen relacionados a la síntesis de proteínas.

26. Métodos Real Time PCR Cuantitativo: • Se diseñaron primers usando Primer Express software (AppliedBiosystems). • El análisis cuantitativo de la expresión se hizo mediante Real-Time PCR qPCRcore kit de SYBR Green (Eurogentec) usando un iCycler iQTM (Bio-Rad). • Reacción de RT-PCR: • 1X reaction buffer • 200 mMdNTP’s • 0.3 mM primer • 0.025 U/ml Hot GoldStar enzyme • 1:66000 SYBR Green • Volumen final of 20 ml

27. Chloroquine Mediated Modulation of Anopheles gambiae Gene Expression. Métodos Real Time PCR Cuantitativo: • Un micro litro de cDNA se usó como templado. • El ciclo de amplificación: • Denaturación inicial a 95°C por 10 minutes. • 40 ciclos de 95°C por 30 segundos, annealing por 1 minuto. • Los niveles de expresión fueron normalizados al nivel de expresión del gene Ribosomalprotein S7 usando una curva de cuantificación estándar.

28. Chloroquine Mediated Modulation of Anopheles gambiae Gene Expression. Resultados • El efecto de la cloroquina en la abundancia de los transcriptos se estudió comparando el nivel de expresión de lo siguiente: • Mosquitos que se alimentaron en sangre conteniendo cloroquina y mosquitos alimentados en sangre normal (Chl 50). • Mosquitos que se alimentaron en sangre infectada con P. berghei conteniendo cloroquina y mosquitos alimentados en sangre infectada con P. berghei sin droga (Chl 50Pb). • El análisis de los Microarrays reveló que ~4.5% de los ESTs de A. gambiaeestaban aumentados o disminuidos al menos 1.5-veces.

29. Chloroquine Mediated Modulation of Anopheles gambiae Gene Expression. Análisis de Microarrays • Gráfica comprando mosquitos que se alimentaron en sangre conteniendo cloroquina y mosquitos alimentados en sangre normal (Chl 50). • Encontraron 126 genes que se regularon con la exposición a cloroquina, 94 bajaron su expresión y 32 aumentaron su expresión, en comparación con el control. Valor promedio Intensidad

30. Chloroquine Mediated Modulation of Anopheles gambiae Gene Expression. Análisis de Microarrays • Gráfica comprando mosquitos que se alimentaron en sangre infectada con P. berghei conteniendo cloroquina y mosquitos alimentados en sangre infectada con P. berghei sin droga (Chl 50Pb). • Encontraron 206 genes se regularon con la exposición a cloroquina, 114 bajaron su expresión y 92 aumentaron su expresión, en comparación con el control. Valor promedio Intensidad

31. Chloroquine Mediated Modulation of Anopheles gambiae Gene Expression. Gráfica de proporciones relativas de los genes regulados • Los genes regulados representan diferentes funciones: • Estrés oxidativo • Inmunidad • Apoptosis • Digestión • Adhesión • Citoesqueleto • Matriz extracelular • Maquinaria de síntesis de proteínas • Regulación de transcripción • Señales de traducción • Metabolismo • Transporte • Funciones desconocidas

32. Chloroquine Mediated Modulation of Anopheles gambiae Gene Expression. Real Time PCR Cuantitativo • Se estudiaron 5 genes para confirmar cuán robusta es la data del Microarray: • Cytochrome c oxidase • Thioredoxin • Elongation factor 1 alpha • C-typelectin CTL4 • Serpin sp121F • Otro gen que confirmó los resultados del Microarray fue gambicin, cuya expresión disminuye en ambos ensayos.

33. Chloroquine Mediated Modulation of Anopheles gambiae Gene Expression. Real Time PCR Cuantitativo • En cuatro de los cinco genes se confirmó la disminución en la expresión observada en el Microarray. • En un gene hubo discrepancias en lo observado por los dos métodos, puede ser por: • Hibridación cruzada con otros genes similares. • Transcriptos con splicing alternativos.

34. Chloroquine Mediated Modulation of Anopheles gambiae Gene Expression. Análisis de Expresión A. gambiaeNOinfectados tratados con cloroquina: • Se enfocaron en los genes involucrados en la respuesta inmune: • Estrés oxidativo/detoxificación: • Observaron 11 genes con disminución en expresión, incluyendo 4 enzimas asociadas a fosforilación oxidativa. • Observaron 2 genes con aumento en expresión. • Respuesta inmune y apoptosis: • Observaron 6 genes que se expresaron diferencialmente.

35. Chloroquine Mediated Modulation of Anopheles gambiae Gene Expression. Resultados

36. Chloroquine Mediated Modulation of Anopheles gambiae Gene Expression. Resultados

37. Análisis de Expresión A. gambiaeinfectados tratados con cloroquina: • Los principales grupos de genes regulados fueron: • Estrés oxidativo • Inmunidad • Maquinaria de síntesis de proteínas • Transporte • Otros con función desconocida • Estrés oxidativo/detoxificación: • Observaron 7 genes con disminución en expresión. • Observaron 5 genes con aumento en expresión. • Sugiere que la droga afecta el sistema de detoxificación del mosquito.

38. Resultados

39. Análisis de Expresión A. gambiae infectados tratados con cloroquina: • Respuesta inmune: • Observaron 11 genes que se expresaron diferencialmente. • Apoya la data previa que sugiere que la cloroquina impacta la respuesta inmune del mosquito. • La mayoría de estos genes se han asociados previamente a una respuesta inmune fuerte del mosquito en contra de la invasión del intestino por parte del parásito.

40. Resultados

41. Resultados • La evidencia obtenida sugiere que la cloroquina disminuye la apoptosis de las células del mosquito durante la invasión del intestino por parte del parasito 24 horas después de la ingestión de la sangre.

42. Resultados • Se ha propuesto que la apoptosis es un mecanismo para reducir la infección, ya que las células dañadas por el parásito son eliminadas y por ende se elimina el parásito. • Por lo tanto, si no hay apoptosis, no se elimina el parásito y esto resulta en un aumento en la infectividad como consecuencia del uso de la droga.

43. Resultados • Los genes de los grupos del adhesión y citoesqueleto se regularon diferencialmente en los mosquitos infectados tratados con cloroquina, pero no en la ausencia de infección. • Se puede deber a la reorganización esqueletal durante la infección, elemento que es clave para la invasión del intestino.

44. Resultados

45. Resumen • La data demuestra que la cloroquina impacta significativamente la abundancia de transcriptos de genes del mosquito implicados en la defensa en contra del parásito y baja la expresión de genes involucrados en: • Inmunidad - Apoptosis - Estrés oxidativo • Citoesqueleto - Adhesión • Esto puede contribuir a la supresión del sistema de defensa del Anopheles y por ende llevar a un aumento de la infectividad del parásito, aunque todavía no se conoce bien el mecanismo mediante el cual esto ocurre.

46. Resumen • Los investigadores proponen que la cloroquina actúa modulando la respuesta inmune y reduciendo la apoptosis y por lo tanto permitiendo una invasión más efectiva por parte del parásito y consecuentemente mayor infectividad. • Estos efectos son evidentes en el modelo murino, sin embargo, es incierto si los resultados puedes ser extrapolados a la malaria humana.

47. Resumen • Es posible que el efecto de la cloroquina en la respuesta inmune del mosquito haya contribuido a la dispersión rápida de la resistencia observada en los pasados 40 años. • Dado que la cloroquina todavía se una para tratar infecciones con P. vivax, P. malariae, P. ovale y P. knowlesi y que se ha propuesto reintroducir la cloroquina en una terapia combinada para tratar P. falciparum, es esencial entender mejor el impacto de los antimalariales en el vector.

48. Agradecimiento • Gracias por su atención.

49. Preguntas