ELVÁLASZTÁSTECHNIKA IV.

1. ELVÁLASZTÁSTECHNIKA IV. HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA Dr. Kremmer Tibor EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest

2. HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIAHYDROPHOBIC INTERACTIONCHROMATOGRAPHY(HIC)

3. TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS • 1971 Affinitási kromatográfiás tölteteknél spacer alkalmazásakor zavaró másodlagos kölcsönhatásokat figyelnek meg • 1972  Shaltiel Hydrophobic Chromatography • Spacer-ligandumként, agaróz hordozóra alkilaminokat alkalmaz • 1973 Hjerten Hydrophobic Interaction Chromatography • PorathHydrophobic Salting-out Chromatography • Kozmotróp sók adagolásával a fehérjék retenciója nő • Hoftsee Hydrophobic Adsorption Chromatography • A ligandum szénláncának növelése és sűrűségének csökkentése növeli az eljárás felbontóképességét • 1976 MorrisHIC (Trends Biochem Sci.) • 1980 - HPLC töltetek • 5-10 m szemcseméret (analitikai) • 20-40 m szemcseméret (preparatív), pórusméret növelése (300Å) • 1986 Nem porózus töltetek (1-3 um) • Perfúziós töltetek (200 és 300-500 nm pórus)

4. HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA (HIC) matrix spacer protein ligandum (domain)

6. HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA (HIC) KÜLÖNBÖZŐ LIGANDUMOK HATÁSA A RETENCIÓRA (Gooding et al. 1984) OH-Propil → Propil → Benzil → i-Propil → Fenil → Pentil  a retenció növekedése 

7. KÜLÖNBÖZŐ ANIONOK ÉS KATIONOK HATÁSA A HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSRA PO43- ~ SO42- ~ CH3COO- ~ Cl- ~ Br- ~ NO3- ~ CIO4- ~ SCN- növekvő besózó - csökkenő kisózó hatás • növekvő kaotrop - csökkenő kozmotrop hatás • NH4+ ~ Rb+ ~ K+ ~ Na+ ~ Cs+ ~ Li+ ~ Mg2+ ~ Ca2+ ~ Ba2+ • Phenyl-Superose, Pharmacia, Uppsala

8. HUMÁN SZÉRUM SAVANYÚ ALFA-1-GLIKOPROTEIN (AGP) ÉS ALFA-1-ANTITRIPSZIN (AAT) ELVÁLASZTÁSA ÉS TISZTÍTÁSA HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIÁVAL Fractogel EMD Propyl oszlop (10x1 cm, 20-40 m) Eluens A – 20 mM Na-foszfát, pH : 7,2 1,1 M NH4-szulfát Eluens B - 20 mM Na-foszfát, pH : 7,2 Lineáris gradiens elúció Áramlási sebesség : 1 mL/perc Detektálás : 278 nm (Oláh, Kremmer, Boldizsár, J. Chromatogr. 2000) (NH4)2SO4 1,5 M

9. REFERENCIA FEHÉRJÉK ELVÁLASZTÁSA HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁVAL M (NH4)2SO4

10. HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIA FEHÉRJÉK OVALBUMINRA VONATKOZTATOTT RELATIV RETENCIÓK

11. Hydrophobic Interaction Chromatography of Proteins Column A: Progel-TSK Butyl-NPR, 3.5cm x 4.6mm ID, 2.5μm particles Column B: Progel-TSK Phenyl-SPW, 7.5cm x 7.5mm ID, 10 μm particles Column C: ProgeI-TSK Ether-5PW, 7.5cm x 7.5mm ID, 10 μm particles Mobile Phase: A - 0.1M phosphate buffer, pH 7.0 and 2.3 → 0M ammonium sulfate (12 min) B - C = 0,1M phosphate buffer, pH 7.0 and 1.8 → 0M ammonium sulfate (60 min) Flow rate: 1mL/min; Temp.: 250 C; Detection: UV 280 nm • Samples: 1.  Myoglobin, 2. Ribonuclesae, 3. Lysozyme, 4. -Chymotrypsin, 5.   -Chymotrypsinogen

12. A HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIA ALAPJAI A FEHÉRJÉK SZORPCIÓJA ÉS RETENCIÓJA II. SÓK HATÁSA A FEHÉRJÉK OLDÓDÁSÁRA • 1 - Kis sókoncentrációk • - ionos kölcsönhatások • - stabilizálás • 2 - Nagy sókoncentrációk • - speciális kölcsönhatások, kozmotróp sópárok, • pl. (NH4)2SO4 • - stabilizálás, majd kicsapódás, •  hidrofób kölcsönhatások

13. HIC - TERVEZÉS

14. A HIDROFÓB KÜLCSÖNHATÁSÚ (HIC) ÉS FORDÍTOTT FÁZISÚ KROMATOGRÁFIA (RPC) ÖSSZEHASONLÍTÁSA Mindkét technikában közös és jellemző: - Az álló fázis a hordozóra kötött apoláris ligandum. - A szorpció oka a hidrofób (apolárIs) kölcsönhatás. - A retenciót döntő módon a hidrofóbicitási viszonyok határozzák meg. - Mindkét technika alkalmas a fehérjék elválasztására.

15. A HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ (HIC) ÉS A FORDÍTOTT FÁZISÚ KROMATOGRÁFIA (RPC) KÜLÖNBSÉGEI • - A HIC liganduma gyengébben apoláris, kisebb a felületi koncentrációja. • A HIC esetén sokkal gyengébb a szorpció, a fehérje natív formában (folded) marad, kisebb a denaturáció esélye. • A RPC esetében az erős szorpció megszüntetheti az eredeti struktúrát (unfolding), itt a retenciót elsősorban az elsődleges szerkezet hidrofób jellege határozza meg. • - A RPC esetében a fehérje spontán kötődik a ligandumhoz. Az elúciót szerves oldószer adagolása okozza. A HIC esetében a fehérje kötődése a tölteten és a retenció mértéke a kozmotróp só adagolásával érhető el. Az elúció a só negatív koncentráció gradiensének eredménye. • A RPC esetében a hidrofób kölcsönhatásért döntően az álló fázis (ligandum) felelős, • a HIC esetében az áramló fázis (eluens) a domináns tényező

16. A HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIA ALAPJAI A FEHÉRJÉK SZORPCIÓJA ÉS RETENCIÓJA I. FEHÉRJÉK "VIZES" KÖZEGBEN • A fehérjék fiziológiás körülmények (pH, ionerősség) között harmadlagos ill. negyedleges szerkezettel (folded) rendelkeznek. • A fehérjék apoláros karakterű aminosav összetevői (Ala, Val, Leu, Tyr, Trp, Phe) a szerkezet belsejébe törekszenek, egy részük azonban a felületre kényszerül (hydrophobic patch). Ez kb. a felület 40%-át képezi, és fontos funkcionális szerepe van a fehérje biológiai aktivitásában. • Frank és Evans (1945) feltételezték, hogy vizes oldatokban a víz molekulái un. "icebergs" formában fedik a hidrofób felületeket. • Némethy és Sheraga (1962) szerint két hidrofób anyag vizes oldatban létrejövő kapcsolata során a víz jégszerű struktúrája mintegy feloldódik és dezorganizálódik (entrópia nő – az energia felszabadulás fedezi az asszociáció energiaigényét) • Vizes oldatokban ezek az erők stabilizálják a fehérjék natív szerkezetét. • A fehérjék a vizes (fiziológiás) közegben általában jól oldódnak (stabilak) és • nem törekszenek hidrofób kapcsolatokra.

17. A HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIA ALAPJAI A FEHÉRJÉK SZORPCIÓJA ÉS RETENCIÓJA III. SÓK HATÁSA A FEHÉRJÉK OLDÓDÁSÁRA • Melander és Horváth (1977)SZOLVOFÓB ELMÉLET • - Az oldódás során az oldószer az oldandó anyagot befogadó üreget (cavity) • képez. • - Az oldhatóság a határfelületi szabadenergia megváltozásának a függvénye, ami • az oldószer felületi feszültségétől függ. • - Az oldat só koncentrációjának (m) növelésével az oldat felületi feszültsége • arányosan változik: • V = Vo + c . R . m R - a víz felületi feszültsége • c - a só moláris felületi feszültség inkrementuma • - c korrelációba hozható a sók (anionok) liotróp sorával (Hofmeister l888). • - Az elmélet a hidrofób kromatográfiás gyakorlat számára legegyszerűbb formájában a retenció kifejezésére alkalmas össszefüggést (lnk - m) ad. • A kapacitási faktor logaritmusa (lnk) a következő egyenlettel fejezhető ki : • ln k = ln kviz + S. m • az egyenes tengelymetszete (elvileg) a tiszta vízben mérhető kapacitási faktor • logaritmusa. • - A konkrét mérések az elmélet számos bizonytalanságára hívják fel a figyelmet.

18. PREFERENTIAL INTERACTION ELMÉLET Timasheff (1959) Arakawa és Timasheff (1982) -  Egy egyensúlyi rendszerben lévő oldathoz adott komponens megváltoztatja a fennálló egyensúlyt. -  Az új komponens nem egyforma mértékben lép kölcsönhatásba a már ott lévő komponensekkel (preferentíal interaction), ezt fejezi ki a preferential interaction paraméter (PIP). -  Mérése a szabadentalpia vagyis a kémiai potenciál változásának mérésével lehetséges, ez arányos a felületi feszültség változással. -  Megállapították, hogy a kisózószerek (kozmotróp sók) a fehérjék környezetében negatív PIP értékkel bírnak, vagyis kizáródnak a fehérjék közeléből. Ennek eredménye egy többlet hidratáció, amely a fehérje kémiai potenciálját megnöveli végezetül kicsapódáshoz vezet. -  A só-fehérje kölcsönhatás két ellentétes hatás eredője: 1. kedvezőtlen felületi feszültség változás 2. kedvező só kötődés A kisózó szerek esetében az első hatás a domináns (egyértékű kationok sói), a besózó szerek esetében a második kompenzálja az elsőt.

19. A ligandum szerkezetének szerepe az albumin kötödésében a hidrofób kölcsönhatású kromatográfiában

23. AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA AFFINITY CHROMATOGRAPHY (AFF)

25. AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA • ALAPELV • Kovalens kötéssel (általában köztes láncon keresztül - spacer, leash, tentacle) hordozó szemcsékre (mátrix) rögzített • különböző funkcionális csoportok (ligandum), amelyek • Az elválasztandó (bio)molekulával specifikus és reverzibiliskölcsönhatásokat képeznek. • Mátrix: • - Poliszacharidok: agaróz                     (Sepharose, Superose) • cellulóz • - Organikus polimerek: • poliakrilamid • hidroxialkil metakrilát (Spheron) • etilénglikol metakrilát (Fractogel) • - kevert agaróz-poliakrilamid        (Ultrogel) • - Silica, "porózus üveg"                (SelectiSphere)

26. AFFINITÁSI KÖLCSÖNHATÁSOK (IMMOBILIZED LIGAND AFFINITY TECHNIOUES) IMMUNOAFFINITY (immunosorption) LECTINS (glycoproteins, oligo-polysaccharides) HORMONES (receptors/carriers/antihormones) PROTEINS (enzymes, immunoglobulins) SUBSTRATES (cofactors, inhibitors, modulators) NUCLEIC ACID binding ligands (oligo(dT)cellulose) VÍRUS binding ligands PHENYL BORONATE binding (cis-diols) IMMOBILIZED METAL ION binding affinity DYE-LIGAND binding affinity - Cibacron Blue F3G-A - Malachit Green (A/T specific) - Phenol Red (G/C specific)

28. LECTINS FOR AFFINITY INTERACTIONS WITH GLYCOPROTEINS • With N-linked sugars • Lectin-AAA • Lectin-DSA • Lectin-GNA • Lectin-MAA • Lectin-SNA • Lectin-PHA-L • Specificity for structures • L-Fuc(l-6)GIcNAcl • Galβ(l-4)GlcNAc- • Man (l-3)62 Man- • SA (2-3)Gal • SA (2-6)Gal • Poly-Gal-GlcNAc- • With O-linked sugars • Lectin-ACA • Lectin-PNA • Lectin-ConA • Lectin-RCA-120 • Lectin-WGA SA(2-3)Galβ(l-3)-GalNAc-Ser/Thr Galβ(l-3) GalNAc-Ser/Thr

29. AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA Ready-to-use group specific adsorbents

30. Sejtmembrán glikoprotein (Na-deoxikolát extraktum) tisztítása L. culinaris lectin-Sepharose 4B oszlopon

31. FESTÉK LIGANDUM AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA DYE-LIGAND AFFINITY CHROMATOGRAPHY

32. DYE-LIGAND AFFINITY CHROMATOGRAPHY OF HUMAN SERUM PROTEINS • FUNCTIONAL GROUP: CIBACRON BLUE F3G-A • AFFINITY PACKING MATERIALS: • (Capacities  10 mg albumin per ml gel) • ~ Blue Sepharose CL-6B (Pharmacia) • ~ Affi-GelR Blue Gel           (Bio-Rad) • ~ Fractogel TSK AF-Blue (Merck), TOYOPEARL AF Blue HC-650M • COLUMN: 6x0.5cmI.D. (Pharmacia 5/5) • CHROMATOGRAPHIC SYSTEM: FPLC (Pharmacia) with LCC-500 Programmer and UV-1 Monitor (278 nm) • ELUTION: • Equilibrated and eluted with 10 mM phosphate buffer • pH: 5.8 or 6.8 • Step gradient elution with 10 mM phosphate buffer • pH:8.0 containing 2 M NaCl • FLOW RATE: 1 ml / min • SAMPLE: 500 μL ~ prepared by Sephadex G-25 • Equivalent to 50 μL of original serum

35. DYE-LIGAND AFFINITY CHROMATOGRAPHY OF HUMAN SERUM PROTEINS COLUMN: Blue Sepharose CL-6B pH:5,8 Human serum samples prepared by Sephadex G-25

37. FENIL BORONÁT AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA

38. PSEUDO-URIDIN MEGHATÁROZÁSA HUMÁN VIZELETBEN

39. PSEUDO-URIDINE DETERMINATION • PRINCIPLE • NUCLEOSIDES (PSEUDO-URIDINE) WITH VICINAL HYDROXYL GROUPS IN THEIR STRUCTURE CAN BE EXTRACTED SELECTIVELY BY AFFINITY CHROMA-TOGRAPHY FROM COMPLEX BIOLOGICAL SAMPLES AND SEPARATED BY REVERSED-PHASE HPLC. • SAMPLE PREPARATION • MICRO-PREPARATIVE BORONATE AFFINITY COLUMN (Affi-Gel 601, Bio-Rad Labs, 5x50 mm) WAS EQULIBRATED WITH 0.25M NH4-ACETATE (pH 8-8). ONE ml URINE WAS MIXED WITH 0.3 ml 2.5M NH4-ACETATE (pH 9.5) AND CENTRIFUGED. 500 μL SUPERNATANT WAS APPLIED ON THE AFFINITY • COLUMN AND WASHED WITH 2x4 ml 0.25M NH 4 - ACETATE (pH 8.8). ELUTION WAS PERFORMED WITH 5 ml 0.1M FORMIC ACID. ELUATE WAS COLLECTED AND FREEZE-DRYED. THE RESIDUE WAS SOLVED IN 250 μL 10mM NH4~PHOSPHATE (pH 5) CONTAINING 2 % METHANOL. • HPLC ANALYSIS • HP 1084B LIQUID CHROMATOGRAPH ISOCRATIC ELUTION WITH 10mM PHOSPHATE BUFFER (pH 5.1) CONTAINING 2% (v/v) METHANOL., • COLUMN: ODS-HYPERSIL (25x0.46 cm, 5u) TEMP: 35°C. FLOW: 1 ml/min. • DETECTION: 254 nm.