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Programmi di sequenziamento genomico nelle piante

Programmi di sequenziamento genomico nelle piante. Arabidopsis Riso Pioppo. Già completati. Mais Pomodoro Soia ……etc. Analisi funzionale dei geni. Mutagenesi inserzionale RNA Antisenso RNAi. (Knock out). Diminuire l’espressione. Mutagenesi inserzionale

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Programmi di sequenziamento genomico nelle piante

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Presentation Transcript

  1. Programmi di sequenziamento genomico nelle piante • Arabidopsis • Riso • Pioppo Già completati • Mais • Pomodoro • Soia • ……etc.

  2. Analisi funzionale dei geni • Mutagenesi inserzionale • RNA Antisenso • RNAi (Knock out) Diminuire l’espressione

  3. Mutagenesi inserzionale • Mutagenesi inserzionale su larga scala

  4. T-DNA tagging • Trasposon tagging

  5. Il trasferimento genico nelle piante Mediato da: • Vettore biologico: Agrobacterium, virus • Diretto: biolistico, microiniezione, etc

  6. Agrobacterium tumefaciens e rhizogenes

  7. Agrobacterium tumefaciens • E’ un patogeno delle piante responsabile del tumore (la galla) • La trasformazione delle cellule della pianta è conseguenza del trasferimento e dell’integrazione nel genoma nucleare della cellula target di una regione (T-DNA) del plasmide Ti (Tumor-inducing)

  8. L’integrazione del T-DNA nel genoma dell’ospite è casuale

  9. NOS-pro NPTII(KanR) NOS-t CaMV35S gene X NOS-t Vettore a T-DNA plasmide Agrobacterium tumefaciens helper LB RB Trasformazione mediata da Agrobacterium tumefaciens Trasforma senza indurre il tumore (disarmato)

  10. Piantine trsformanti (verdi; KanR) di Arabidopsis thaliana

  11. Arabidopsis thaliana (pianta modello) il cui genoma è stato completamente sequenziato ( 2000) 225.000 linee inserzionali (T-DNA) Arabidopsis Biological Stock Center (Ohio S.U.) Nothingham Arabidopsis stock center (NASC) Breve sequenza del DNA genomico fiancheggiante l’inserto permette di stabilirne la posizione nel genoma

  12. Trasposoni

  13. Barbara McClintock (1902 –1992) Ds dissociation (non autonomo); Ac Activator (autonomo)

  14. Ac: 4563 bp IR : sequenze ripetute (imperfette) terminali 11bp Un gene che codifica per la trasposasi (807 aa)

  15. Come può essere utilizzato il trasposon (e T-DNA tagging) la sequenza del genoma: • è disponibile Assegnare una funzione ai geni • non è disponibile Individuare, clonare e caratterizzare geni (anche su larga scala)

  16. Trasposizione generalizzataMu (mais) (tutto il genoma) Trasposizione “bersaglio” specificaAc/Ds (una regione genomica)

  17. Mu (mutator) • 70-90% degli elementi Mu si inserice nei geni • le inserzioni si verificano tardivamente nelle cellule germinali • si inseriscono con alta frequenza sia in loci associati che non associati e qui rimangono stabili e trasmissibili attraverso la linea germinale • non vengono persi e continuano a replicarsi (saturation mutagenesis)

  18. Elemento Mu

  19. Rescue Mu Consiste in un plasmide inserito in un elemeto Mu non autonomo

  20. pBluescript: plasmide batterico ad alto numero di copie • Lc (Leaf color): fattore trascrizionale richiesto per la prod. antocianine • viene cotrasformato con pAHC20 (resistenza al Basta) • le linee cotrasformate devono esser incrociate con una linea che porta un MuDr attivo per potere trasporre.

  21. Rescue Mu • Accelerare la scoperta e la caratterizzazione di geni mutagenizzati con Mu che presentino un fenotipo di interesse • Recupero del plasmide 5-20 Kb di DNA, fiancheggiante l’elemento Mu, in forma plasmidica facilmente sequenziabile (non occorre costruire una libreria genomica del mutante)

  22. Non solo inserzioni germinali, ma anche somatiche tardive (cellule della foglia) • Difficilmente danno un fenotipo e difficilmente vengono trasmesse alla progenie • Una nuova risorsa per costruire librerie batteriche di DNA genomico di Mais arricchito in sequenze eucromatiche

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