Il sequenziamento genico

1. Il sequenziamento genico

2. Struttura del DNA • Doppia elica formata da due filamenti di ac. nucleico uniti da ponti ad idrogeno • Ac. nucleico: catena di nucleotidi • Nucleotide: nucleoside + ac. fosforico • Nucleoside: desossiribosio + base azotata • Basi azotate: adenina, citosina, guanina e timina

3. Le basi azotate • Unico elemento variabile all’interno dell’ac. nucleico • Sequenziamento: individuazione della successione delle basi azotate nel filamento di ac. nucleico

4. Le basi azotate • Complementarità fra i due filamenti: • A-T • G-C • 5’-3’: forward • 3’-5’: reverse

5. Sintesi del DNA

6. Prima del sequenziamento • Scelta del bersaglio • Presente in tutti gli organismi • Conservato ma contenente regioni variabili • Disponibilità di un database contenente le sequenze con cui si vuol confrontare il bersaglio • Scelta dei primer • Estrazione del DNA dalle cellule

7. Le fasi del sequenziamento • Amplificazione del bersaglio • Verifica dell’amplificato • Purificazione • Verifica • PCR di sequenziamento • Purificazione dell’amplificato

8. Miscela di sequenziamento • Primer • Due amplificazioni parallele usando in ciascuna un solo primer (per i filamento forward o reverse) • Tampone • Polimerasi • Nucleotidi • Nucleotidi terminator

9. Nucleotidi terminator • Nucleotide (A) che blocca l’allungamento del filamento di ac. nucleico poiché la mancanza del gruppo ossidrile in 3’ impedisce l’attacco all’ac. fosforico del nucleotide successivo

10. PCR di sequenziamento (metodo manuale) • Si esegue in quattro provette diverse • Tutte e quattro le provette contengono: polimerasi, nucleotidi normali e primer • Ciascuna delle quattro provette contiene inoltre un diverso tipo di nucleotide terminator (adenina-terminator, guanina-terminator, . . .) • Annealing del primer • Allungamento del primer: • Legame di un nucleotide normale: l’allungamento prosegue • Legame di un nucleotide terminator: l’allungamento si blocca • In ciascuna delle 4 provette contenente nucleotidi terminator con una diversa base azotata si formano soltanto filamenti che terminano con tale base. Tali filamenti avranno tutte le lunghezze possibili a seconda che il nucleotide terminator si sia legato alla 1°, 2°, . . , ennesima, posizione possibile

11. Il principio del sequenziamento (metodo manuale) • Si esegue una elettroforesi disponendo i prodotti di amplificazione delle 4 provette in 4 corsie parallele così che in ognuna di esse siano presenti filamenti che terminano con una diversa base • Si usa un gel ad altissima risoluzione, capace di separare frammenti di DNA che differiscono fra loro per un solo nucleotide. Il gel (0,3-0,4 mm di spessore) è interposto fra due lastre di vetro di notevole lunghezza (40 cm circa ).

12. Il principio del sequenziamento (metodo manuale) • La migrazione è inversamente proporzionale alla lunghezza del filamento • La posizione della banda indica la posizione occupata all’interno della sequenza, mentre il tipo di base è indicato dalla corsia in cui tale banda si trova A T A C A G C T G T T . . . . . .

13. Nucleotidi terminator marcati(metodo automatico) • I nucleotidi terminator sono marcati con un fluorocromo • Si usa un fluorocromo diverso per ciascuno dei quattro tipi di terminator

14. PCR di sequenziamento (metodo automatico) • Si esegue in una singola provetta • Tutte le provette contengono: polimerasi, nucleotidi normali, nucleotidi terminator e primer • I nucleotidi terminator sono marcati con fluorocromi • Annealing del primer • Allungamento del primer: • Legame di un nucleotide normale: l’allungamento prosegue • Legame di un nucleotide terminator: l’allungamento si blocca • Nella provetta si formano contemporaneamente filamenti che avranno tutte le lunghezze possibili a seconda che il nucleotide terminator si sia legato alla 1°, 2°, . . , ennesima, posizione della sequenza. Si avranno quindi contemporaneamente filamenti terminanti con ciascuna delle quattro basi

15. Il prodotto della PCR (sequenziamento automatico) • Se il bersaglio è composto da n nucleotidi si avranno filamenti di tutte le lunghezze possibili, da 1 ad n • Indipendentemente dalla lunghezza, tutti i filamenti terminanti con adenina emetteranno fluorescenza di tipo A ; quelli terminanti con citosina, di tipo B; quelli terminanti con guanina, di tipo C, e quelli terminanti con timina, di tipo D

16. Il sequenziatore automatico • E’ un apparecchio che, dopo aver prelevato il prodotto della PCR di sequenziamento, lo sottopone ad elettroforesi all’interno di un capillare • Un raggio laser colpisce il capillare eccitando la fluorescenza dei fluorocromi che lo attraversano • Un cellula fotoelettrica rileva i segnali fluorescenti che vengono memorizzati

17. L’elettroferogramma • Durante l’attraversamento del capillare i vari spezzoni di DNA vengono colpiti da un raggio laser • Il raggio laser eccita i vari fluorocromi che marcano i singoli spezzoni • Ciascuno dei quattro fluorocromi emette una diversa lunghezza d’onda • Una cellula fotoelettrica rileva sequenza, tipo ed intensità delle varie emissioni luminose ed il tutto viene registrato in forma grafica • La sequenza dei picchi corrisponde alla sequenza dei nucleotidi; il tipo (colore del picco) corrisponde al tipo di base azotata mentre l’intensità (altezza del picco) è irrilevante

18. L’elettroferogramma • Normalmente il sistema interpreta automaticamente l’elettroferogramma • Quando l’interpretazione non è ovvia, il sistema inserisce una N al posto della base azotata mancante, questa può essere corretta manualmente, dopo aver letto ad occhio l’elettroferogramma, o in base alla sequenza del filamento reverse G

19. Il sequenziamento in microbiologia • Identificazione • Sequenziamento di regioni specie-specifiche • Antibiogramma • Sequenziamento di regioni in cui possono aversi mutazioni associate alla resistenza ai farmaci • Filogenesi • Confronto della sequenza della medesima regione in specie diverse, per ricostruirne la storia evolutiva

20. Identificazione mediante sequenziamento • Scelta della regione da sequenziare • 16S rDNA • Internal transcribed spacer • 23S rDNA • hsp65 • rpoB • Sequenziamento • Confronto della sequenza con quelle presenti in un database

21. GenBank • Banca dati pubblica (in Internet) contenente circa 50 milioni di sequenze geniche delle più varie regioni di, praticamente, tutti gli organismi viventi • Chiunque può depositare (ovviamente non in maniera anonima) sequenze in GenBank • E’ possibile confrontare la propria sequenza con tutte quelle presenti in GenBank • Un motore di ricerca individua e restituisce le sequenze presenti in GenBank che hanno il più elevato grado di somiglianza con la sequenza in esame

22. GenBank BLAST

23. GenBank BLAST

24. GenBank, risultati

25. GenBank, risultati

26. GenBank, risultati

27. Interpretazione • Identità 100% con una specie nota • Identità 100% con una sequenza non appartenente a specie conosciute • Identità <100% con una specie nota (il significato varia a seconda della regione in esame) • Verifica delle discordanze • Correzione della sequenza (identità 100%) • Nuovo sequevar • Nuova specie

28. Antibiogramma mediante sequenziamento • Scelta della regione da sequenziare • rpoB • katG • embB • pncA • Sequenziamento • Confronto con la sequenza wild type

29. Interpretazione • Confronto con la sequenza wild type • Identità 100% = sensibilità • Mutazioni = resistenza • Conferma con l’antibiogramma fenotipico

30. Allineamento delle sequenze

31. Allineamento delle sequenze

32. Le mutazioni • Principali mutazioni • Inserzione • Delezione • Sostituzione • Conservativa • Non conservativa • Mutazioni: errori della natura? • La selezione naturale premia le mutazioni favorevoli e elimina quelle sfavorevoli • Regioni genetiche più o meno tolleranti

33. Mutazioni e filogenesi • Evoluzione da un organismo ancestrale • Sviluppo di nuovi organismi per effetto di mutazioni e selezione naturale • Il numero, il tipo e la posizione delle mutazioni comparse, in regioni conservate, durante l’evoluzione costituiscono il metro con cui è possibile misurare le distanze filogenetiche • Numero di mutazioni tanto più elevato quanto più remoto è il progenitore ancestrale • Organismi con mutazioni concatenate appartengono allo stesso phylum

34. Regioni di studio • Ideale: l’intero genoma • Compromesso accettabile:16S rRNA • Sequenziamento • Multiallineamento • Costruzione dell’albero filogenetico

35. L’albero filogenetico 4 mutazioni 5 mutazioni 5 mutazioni 7 mutazioni 4 mutazioni 2 mutazioni

36. L’albero filogenetico 4 mutazioni 5 mutazioni 5 mutazioni 7 mutazioni 4 mutazioni 2 mutazioni

37. L’albero filogenetico, limiti • Non sempre, alberi basati su sequenze di regioni diverse, sono compatibili • Non sempre alberi basati sulle stesse sequenze, ma costruiti con algoritmi diversi, sono sovrapponibili

38. Conclusioni • L’uso del sequenziamento per l’identificazione e l’antibiogramma è particolarmente vantaggioso con: • Organismi a crescita lenta • Organismi difficilmente coltivabili • Organismi non coltivabili • Organismi morti (paleomicrobiologia) • Per l’identificazione il sequenziamento è il metodo di riferimento; NON lo è per l’antibiogramma • Il sequenziamento è una metodica: • Rapida • Automatizzata • Economica