Quantifizierung prostataspezifischer Transkripte in regionären Lymphknoten

1. 10,0 Probe Konz. Cros.Pkt. Wasser Standard 100 pg 17,9 Standard 10 pg 21,8 Standard 1 pg 25,8 Standard 100 fg 30,1 Pos. 1:10 22,5 Pos. 1:100 25,9 1,0 0,1 10,0 1,0 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 0,1 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 Quantifizierung prostataspezifischer Transkripte in regionären Lymphknoten von Patienten mit Prostatakarzinom Ulrike *Fiedler, Romy *Kranz, Andreas Manseck, M. P. Wirth Klinik und Poliklinik für Urologie, Technische Universität Dresden [weitere Infos: www.tu-dresden.de/meduro oder an axel.meye@mailbox.tu-dresden.de] Patienten und Methode Von 60 Prostatakarzinom-Patienten, die sich einer radikalen Prostatektomie unterzogen, wurden 2-6 regionäre Lymphknoten entnommen. Eine Gewe-behälfte wurde pathologisch begutachtet, von der anderen wurde RNA isoliert. Eventuell noch vorhandene DNA wurde mittels DNase I entfernt und jeweils 4 µg RNA in cDNA umgeschrieben. Diese cDNA (jeweils 2 µl) diente als Ausgangs-material für die PCR-Analysen. Die PCR’s wurde mit den Primern für das house keeping Enzym GAPDH durchgeführt, um die Qualität der cDNA sowie deren Menge für die quantifizierenden Analysen zu bestimmen. Mit 60 Patienten wurden qualitative PCR-Analysen durchgeführt (Block-Cycler PCR, Produkt-Analyse im Agarosegel). 57 Patienten gingen in die quanti-fizierenden PCR-Analysen mit dem Light-Cycler der Firma Roche ein. Dabei wurden externe Stan-dards (Plasmid mit klonierten PCR-Produkten) für die Quantifizierung und spezifische Hybridisie-rungsproben für den Nachweis der PCR-Produkte verwendet. Die Menge an spezifischen Trans-kripten wurde auf eine durchschnittliche GAPDH-Transkriptmenge pro µg Gesamt-RNA bezogen. Quantitative PCR-Analytik Einleitung Die reverse Transkriptase Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) ist eine Technik, mit der die Expression spezifischer Gene mit sehr hoher Sensitivität und Spezifität nachgewiesen werden kann. Bei Prostatakarzinom (PCa)-Patienten sind die regionären Lymphknoten primäre Ansiedlungsorte metastasierender Tumorzellen. Eine Metastasierung der Lymph-knoten kann derzeit nur histopathologisch abgeklärt werden. Ziel der Studie ist es, mittels qualitativer oder quantitativer RT-PCR-Analysen für ausgewählte prostataspezifische Marker einen sensitiveren Nachweis für disseminierte Tumorzellen in regionären Lymphknoten zu entwickeln. Im Ergebnis dieser Studie und im Rahmen von Nachsorgeuntersuchungen könnten Schwell-werte für die einzelnen Marker bestimmt wer-den, die auf eine Metastasierung bzw. ein schlechte Prognose hinweisen. Als Marker wurden das prostataspezifische Antigen (PSA) und zwei Splice-Varianten des prostata-spezifischen Membranantigens PSM und PSM’ verwendet. 10,0 GAPDH-Standards log F2/F1 Fluoreszenz 1,0 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 0,1 Anzahl der Zyklen GAPDH-Standardkurve 31 30 Crossing points 29 unbekannte Konzentration 28 27 crossing points 26 Lineare Regression 25 24 23 22 21 20 19 18 17 2.0 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 3.0 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 4.0 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 5.0 log Zyklenzahl Ergebnisse Die qualitativen RT-PCR-Analysen brachten hin-sichtlich des Markers PSA keine Verbesserung gegenüber der histopathologischen Untersu-chung. Besonders bei vorbehandelten N+-Pa-tienten konnte nicht immer ein PSA-Signal er-halten werden. PSM-Transkripte wurden in fast allen (57/60) und PSM’-Transkripte in 37/60 Pa-tienten nachgewiesen. Mit den quantitativen Analysen wurden in allen Lymphknoten PSA-Transkripte, in allen N+ und in 35/40 N0 PSM-Transkripte sowie in 10/14 N+ und 9/40 N0-Patienten PSM’-Transkripte festgestellt. Die Menge an PSA-Transkripten betrug in N+-Patienten durchschnittlich 1,7x106/µg RNA und sank bei hormonell vorbehandelten N+-Patienten auf 1,4x105. Dagegen sank die Menge an PSM und PSM‘-Transkripten in N+-Patienten bei Vor-behandlung nur geringfügig von 1,0x106 bzw. 2,6x106 auf 8,3xE105 bzw. 1,8x10E6. Die PSA und PSM’-Bestimmungen ergaben, daß N+-Pa-tienten durchschnittlich 4,5-5 mal mehr Transkripte als N0-Patienten haben. Übersicht der positiven qualitativen Lymphknoten PCR‘s PSA-Analysen log F2/F1 Anzahl der Zyklen Übersicht der positiven quantitativen Lymphknoten PCR‘s 1 2 3 4 5 6 7 8 M Probe Konz. Cros. pt. Wasser Standard 10 pg 17,0 Standard 1 pg 20,6 Standard 100 fg 24,3 Standard 10 fg 27,9 1 21,4 2 18,5 3 20,3 4 21,8 5 21,4 6 21,2 7 21,4 8 32,8 Vergleich der quantitativen (Light-Cycler) und qualitativen (Agarosegel) PCR-Analysen für den Marker PSA. Tab. 1: Übersicht der positiven qualitativen Lymphknoten PCR‘s. Bestimmung der Transkriptmengen in den Lymphknoten PSM-Analysen Schlußfolgerungen Während mit den qualitativen RT-PCR’s nur eine ja/nein-Aussage bzgl. des Vorhandenseins von spezifischen Transkripten getroffen werden kann, ermöglichen die quantitativen RT-PCR-Analysen mit dem Light-Cycler einen sehr sensitiven und spezifischen Nachweis unter Angabe der ge-nauen Transkriptmengen. Durch Auswertung des follow up’s könnten dadurch erstmalig Schwell-werte für die einzelnen Transkripte bestimmt werden, die für eine Metastasierung bedeutend sind. Für eine Verbesserung gegenüber der histopathologischen Begutachtung scheint die quantitative Bestimmung aller drei Marker not-wendig, speziell dann, wenn es sich um vorbe-handelte Patienten handelt. log F2/F1 Anzahl der Zyklen 1 2 3 4 5 6 7 8 M Probe Konz. Cros. pt. Wasser Standard 100 pg 19,8 Standard 10 pg 23,6 Standard 100 fg 27,5 1 27,9 2 25,4 3 23,8 4 21,8 5 25,1 6 21,6 7 25,7 8 35,9 Die Transkriptmengen wurden auf 1 µg gesamt-RNA und einen einheitlichen GAPDH-Wert bezogen. Die angegebenen Mittelwerte wurden aus allen Werten einschließlich der Nullwerte ermittelt. LK: Lymphknoten TK: Transkriptmengen vb: hormonell vorbehandelt Vergleich der quantitativen (Light-Cycler) und qualitativen (Agarosegel) PCR-Analysen für den Marker PSM.