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Lunes 04.03.13

Teórico Práctico. Lunes 04.03.13. Diseño, ejecución y reporte de experimentos de retrotranscripci ó n seguida de reacci ó n en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real RT - qPCR. Modelo Experimental. Resultado Esperado…. Sangre. Hígado. DIA 0. AA1 AA2 AA3 AA4. C1 C2 C3

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Lunes 04.03.13

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Presentation Transcript

  1. Teórico Práctico Lunes 04.03.13 Diseño, ejecución y reporte de experimentos de retrotranscripción seguida de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real RT-qPCR

  2. ModeloExperimental

  3. Resultado Esperado… Sangre Hígado

  4. DIA 0 AA1 AA2 AA3 AA4 C1 C2 C3 C4 DIA 1 100 ul Sangre + 1 mL TriPure -80°C 10 mg Hígado + 1 mL TriPure + Homog -80°C

  5. DIA 2 Extracción de ARN • Lisis • Desnaturalización de proteínas • Conservación de ácidos nucleicos • Separación de fases 1) TriPure (TriZol) Isotiocianato de Guanidina Fenol 2) PureLink RNA Minikit • Lisis • Desnaturalización de proteínas • Conservación de ácidos nucleicos • Membranas de sílica (unión al ARN) Isotiocianato de Guanidina Columnas de purificación

  6. Método rápido • Mínima contaminación con ADN • Alto rendimiento de purificación de ARN • ARN de alta calidad y pureza

  7. ARN obtenido… • Cuantificación (A260) • Estimación de la pureza (A260/280) • Chequeo de la integridad (Gel Agarosa 1.5%)

  8. DIA 3 Tratamiento con DNasa No “estrictamente” necesario si se diseñan primers que hibriden en la unión intrón-exón Control del tratamiento con DNasa Sin retrotranscriptasa

  9. Mix I Mix II Mix III • Oligo-dT • dNTP • Mix Oligos • Buffer • DTT • RNase OUT • Buffer • DTT Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV) H20 SLO – miR-122 SLO – miR-16 SLO – miR-Let7a 5S RT 18S RT Síntesis de cDNA The SuperScript III enzyme is a version of MMLV reverse transcriptase that has reduced RNaseH activity, a longer half-life (220 minutes) and is more thermostable, resulting in increased specificity and higher yields.

  10. DIA 4 miR-122 miR-16 miR-Let7a 18S 5S FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) (ROCHE) Real Time PCR SYBR Select Master Mix (APPLIED BIOSYSTEM) • Control negativo (No template control, NTC) • Control positivo

  11. ROX: reactivo fluorescente pasivo Normaliza diferentes fuentes de variabilidad entre wells • Errores de pipeteo • Limitaciones del instrumental (óptica del sistema) FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) (ROCHE) SYBR Select Master Mix (APPLIED BIOSYSTEM) Heat-labile Uracil-DNA Glycosylase (UDG) dNTP blend containing dUTP/dTTP Treatment with heat-labile UDG can prevent the reamplification of carryover PCR products by removing any uracil incorporated into single- or double-stranded amplicons (Longo et al., 1990).

  12. DIA 5 • Curvas de amplificación y de melting • Threshold, línea de base • NTC: contaminación o dímeros de primer? • Control positivo • Desviación estándar de las réplicas técnicas • Desviación estándar de las réplicas de RT • Control de la Normalización • Procesamiento analítico de los Cq Análisis de resultados Análisis Estadístico

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