1 / 74

Kapalinová chromatografie v analytické toxikologii

Kapalinová chromatografie v analytické toxikologii. Věra Pacáková Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta, katedra analytické chemie. Obsah. 1.   Úvod 2.   Principy HPLC 3.    Instrumentace 4. Úprava vzorku 5 .    Analýza drog a jejich metabolitů 6 . Závěry. 1. Úvod.

khan
Download Presentation

Kapalinová chromatografie v analytické toxikologii

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Kapalinová chromatografie v analytické toxikologii Věra Pacáková Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta, katedra analytické chemie

  2. Obsah 1.   Úvod 2.   Principy HPLC 3.   Instrumentace 4. Úprava vzorku 5.   Analýza drog a jejich metabolitů 6. Závěry

  3. 1. Úvod GC – obvykle vyžaduje derivatizaci, bezvodé vzorky HPLC - doplňuje a nyní i nahrazuje GC Výhody – 85 % všech látek lze stanovit (tepelně labilních, polárních, nízko- i vysoko-molekulárních), přímá analýza bez derivatizace – časová úspora, přímý nástřik vodných vzorků Ve spojení s citlivou detekcí – MS – možnost identifikace a kvantifikace Nevýhody: pomalá difúze v kapalinách, nižší účinnost než GC, vyšší finanční náklady na analýzu (nákladnější přístroj, rozpouštědla)

  4. 2. Principy HPLC • Mobilní fáze: kapalina složení mobilní fáze ovlivňuje separaci • Stacionární fáze: chemicky vázané fáze adsorbenty měniče iontů gely (pro SEC) afinitní fáze Vysoká účinnost a rychlost analýzy – vysoké tlaky a malé částice s jednotnou velikostí, homogenně naplněné v koloně

  5. Chromatogram(kvalita, kvantita, účinnost separace) tR – retenční čas, t´R – redukovaný čas, plocha nebo výška píku, w – šířka píku

  6. Závislost Hna lineární průtokové rychlosti mobilní fáze u H (výškový ekvivalent teoret. patra) = L/n n (počet pater) = 16(tR/w)2

  7. Závislost H na velikosti částic Čím < velikost částic, tím < H a tím > účinnost separace 8 m 5 m 3 m 2 m

  8. Volba kolony Náplně: • zcela porézní částice 2- 10 m, velikost pórů 10 – 50 nm, pravidelného kulovitého tvaru, homogenně naplněné v koloně • pelikulární– polopropustné (nepropustné jádro, tenká pórovitá vrstva • nepórovité – rychlá sorpce, malá zátěž, póry 0,2 – 0,4 nm nedostupné pro solut • monolitické kolony, vtištěné polymery Specifický povrch zátěž (dávkování) póry 10 nm  170 m2 30 nm 100 m2 nepórovité  0,6 – 6 m2/g

  9. Miniaturizace (HPLC) Zmenšování velikosti částic a průměru kolony Výhody: • snížení spotřeby a odpadu rozpouštědel, stacionární fáze a vzorku • vyšší účinnost separace • vyšší citlivost detekce • kompatibilita s MS detekcí Průměr kolony Průtok 4,5 mm 1 mL/min 1 mm 0,047 mL/min 0,25 mm 0,003 mL/min

  10. Chemicky vázané fáze • Univerzální, vhodné pro biologické vzorky, rychlé ustavování rovnováhy- vysoká separační účinnost • Nosič (silikagel, organický polymer) s navázanými funkčními skupinami: alkyly, zejména oktyl, oktadecyl, fenyl – nepolární (reverzní) fáze – nejvýznamnější (RPLC) normální fáze – polární – méně používané iontově výměnné skupiny -SO3H, - COOH, -NH2, -N+(R)3 chirální stacionární fáze (cyklodextriny a další)

  11. Struktura chemicky vázaných fází

  12. Mobilní fáze • Mobilní fáze není inertní, ovlivňuje separaci • Možnosti změny složení mobilní fáze jsou prakticky neomezené • Obecné požadavky: dobrá rozpustnost pro soluty, kompatibilita s detekcí (UV hrana), toxicita, viskosita, těkavost • reverzní fáze – voda + organická rozpouštědla (pufry, pH, iontově párová činidla…) retence (log k) ~ obsah org. rozpouštědla • nepolární fáze – nepolární organické rozpouštědlo + polární modifikátor (<1 %) • měniče iontů – pufry Izokratická vs. gradientová eluce (obdoba programování teploty v GC)

  13. Derivatizace • Derivatizací měníme fyzikální a chemické vlastnosti analytů. Hlavní důvody pro převedení analytů na deriváty jsou tyto: • zlepšení detekovatelnosti (nejčastěji v kombinaci s fluorescenčním detektorem) • zvýšení těkavosti (v GC) • zlepšení chromatografických vlastností (např. změna polarity), • zlepšení stability analytů, • umožnění chirální separace, • změna matrice pro lepší separaci.

  14. Kvalitativní analýza k = (tR – tM) /tM (retenční poměr) r12 = 12 = t´R2/t´R1 = k2/k1 (relativní retence, selektivita) Reprodukovatelnost: složení mobilní fáze, pracovní teplota, příprava stacionární fáze

  15. Kvantitativní analýza Zdroje chyb: • Odběr reprezentativního vzorku • Úprava vzorku(nejvýznamnější) • Dávkování (1-2 %) • Stacionární fáze • Instrumentace, zpracování signálu a interpretace

  16. Pracovní techniky při vyhodnocování chromatogramů A – plocha m – množství Vi, Vs – objemy při ředění vi,vs – dávkované objemy vzorku a stand. RMR – relativní mol. odezva • Vnitřní normalizace: xi = (Ai / Aj )  100 • Absolutní kalibrace mi = (Ai/As) ms • Vnitřní standardizace mi = (RMRsr/RMRir) (Ai/As) (Vs/ Vi) ms • Metoda standardního přídavku

  17. 3. InstrumentaceBlokové schéma chromatografu1 - zdroj mobilní fáze, 2 – čerpadlo, 3 – dávkovač,4 - kolona, 5 - detektor, 6,7 - zařízení pro zpracování signálu detektoru

  18. Zásobník m.f. – uzavřená nádoba, odplynit • čerpadla – bezpulzní, vysokotlaká, průtoky od l/min po mL/min • dávkovače – smyčkové (vzorky v l) automatické dávkovače • kolony – preparativní či analytické, náplňové i kapilární, vnitřní průměr od desítek m po jednotky mm, nerezové či skleněné • detektory – spektrofotometrický (diode-array) refraktometrický, elektrochemický, fluorescenční,hmotnostní • vyhodnocovací zařízení

  19. Čerpadlo reciprokační

  20. Schéma šesticestného dávkovacího ventilu se smyčkou a - plnění smyčky, b - vymývání smyčky do kolony 1, 4 - připojení smyčky, 2 - přívod mobilní fáze od čerpadla, 3 - připojení kolony, 5, 6 - odpad; nástřik v poloze 4

  21. Kolony: • náplňové  3 – 5 mm, ~ 1 mL/min • mikronáplňové ~ 1 mm, ~ 20 - 60 L/min • kapilární ~ 10 m, ~ nl/min • Materiály: silikagel (pH 2-8, endcapping) alumina (pro bazické látky) organické polymery Monolitické kolony Vtištěné polymery

  22. Monolitické kolony • až 97 % objemu kolony zaujímá stacionární fáze (oproti ca 70 % u náplňových kolon) • vyšší účinnost separace • velká porozita  vysoký průtok, rychlé analýzy makropóry –2 m velký průtok, malý tlakový spád mesopóry – 13 nm  velký povrch pro sorpci analytů • na bázi silikagelu nebo organických polymerů

  23. Detektory • UV/VIS – nejběžnější, s diodovým polem (DAD), téměř univerzální • fluorescenční – citlivý, selektivní, derivatizace • elektrochemický- citlivý i selektivní, omezené použití • hmotnostní – nejvyšší vypovídací schopnost (kvalita i kvantita), vysoká citlivost a selektivita

  24. UV/VIS detektor(a)schéma, (b) uspořádání mřížky

  25. Schéma fluorescenčního detektoru 1, 2 - vstup a výstup mobilní fáze, 3 - excitační záření, 4 - emitované záření, 5 ‑ vnější plášť cely, 6 - optický systém, 7 - cela (5 l), 8 - držák

  26. Blokové schéma hmotnostního spektrometru

  27. Iontový zdroj- převedení analytu do ionizovaného stavu, fragmentace. • Hmotnostní analyzátor rozděluje v prostoru nebo čase směs iontů o různých poměrech hmotnosti ku náboji (m/z), produkovanou v iontovém zdroji. • Detektor poskytuje analogový signál úměrný počtu dopadajících iontů. • Po digitalizaci převeden do počítače a zpracován do hmotnostních spekter. • Hmotnostní spektrometr pracuje za velmi nízkých tlaků - výkonnývakuový čerpací systém. • Vstupumožňující převedení vzorku do iontového zdroje. • GC-MS nebo HPC-MS vhodné rozhraní(interface) snižující podíl mobilní fáze

  28. Iontové zdroje • Ionizační energie 7-16 eV • Výtěžek ionizace kolem0,01% • Ionizační techniky měkké(nízká fragmentace) atvrdé (vysoká fragmentace) GC • Ionizace elektronem (electron ionization, EI) • Chemická ionizace (chemical ionization, CI) HPLC Sprejové ionizační technikyv kapalné fázi, měkké • termosprejová ionizace (thermospray, TS) • elektrosprejová ionizace (electrospray, ES) • chemické ionizace za atmosférického tlaku (atmospheric pressure chemical ionization, APCI )

  29. Schéma iontového zdrojeES

  30. Schéma iontového zdroje APCI

  31. Analyzátory • Magnetický hmotnostní analyzátor • Kvadrupólový analyzátor • Iontová past (ion-trap) • Průletový analyzátor (time of flight, TOF)

  32. Interface • Rozhraní s pohybujícím se kovovým páskem (moving belt interface) • sprejové ionizace – většina těkavých látek odvedena mimo MS – bez interface • mikroHPLC - přímý vstup MS/MS-LC • systém se třemi kvadrupóly: První pro výběr mateřského iontu, do druhého se přivádí pod tlakem inertní plyn a slouží jako kolizní cela pro řízenou fragmentaci mateřského iontu, skenováním třetího kvadrupólu se rozdělí vzniklé dceřiné ionty

  33. Rozhraní (interface) s pohybující se kovovou smyčkou

  34. Hybridní tandemový hmotnostní spektrometr s dvojicí kvadrupólů a průletovým hmotnostním analyzátorem

  35. Požadavky na HPLC-MS systém • Kolona – malý průměr, malé průtokové rychlosti  přímý převod do MS (bez interface) • Mobilní fáze těkavá, omezit obsah solí, protože snižují výtěžek ionizace a zanášejí iontový zdroj • Vhodnější methanol než acetonitril, vyšší výtěžek ionizace

  36. 4. Úprava vzorku – přečištění, zakoncentrování Kapalné vzorky (moč, serum, sliny): • extrakce kapalinou (LLE) • extrakce tuhou fází (SPE) – nejběžnější materiály: chemicky vázané fáze, ionexy, SEC fáze, vtištěné polymery, atd. • mikroextrakce na vláknech nebo v kapiláře (SPME) Tuhé vzorky (tkáně, vlasy): • Soxhlet • zrychlená extrakce rozpouštědly (ASE) • extrakce ultrazvukem • extrakce nadkritickými tekutinami (SFE)

  37. SPME Solid phase micro-extraction

  38. a-SPME extrakce, b-desorpce v GC, c-desorpce v HPLC

  39. Přímé spojení SPME v kapiláře s HPLC a) extrakce

  40. b) Desorpce

  41. Příprava vtištěných polymerů

  42. 5. Analýza drog a jejich metabolitů Analýza tělních tekutin • Analýza krve - deproteinizace • extrakce rozpouštědly (LLE) • extrakce tuhou fází (SPE, SPME) • přečištění extraktu na měničích iontů • zakoncentrování odpařením • vlastní analýza HPLC-ESI (API)-MS

  43. Analýza vlasů • Odběr vzorku – velká variabilita (místo odběru, stáří, pohlaví) - 10 – 250 mg vzorku • dekontaminace vlasů (kosmetické přípravky, prach a pod.) • extrakce, přečištění extraktu, zakoncentrování • vlastní analýza

  44. (A) Chromatogram extraktu z krve oběti předávkovanéamobarbitalem(B) hmotnostní spektrum této látky

  45. Rychlá HPLC-ESI-MS identifikace a kvantifikace významných nox Podmínky analýzy • Gradientová elucemetanolem s 0,1% HCOOH • Monolitická kolona Chromolith • Detekce ESI-MS • Doba analýzy 5 min. včetně stabilizace • Všech 14 látek (neutrální, bazické, kyselé) jsou účinně ionizovány pozitivní ESI • Detekční limity 10,0 až 50,0 ng/ml (K. Pihlainen et al., J. Chromatogr. A, 994 (2003) 93–102)

  46. (I)amfetamin, (II)3,4-MDMA, (III)buprenorfin, (IV)clenbuterol, (V)salbutamol, (VI)LSD, (VII)metandienon, (VIII)nandrolon, (IX)stanozolol, (X)testosteron, (XI)morfin, (XII) fenobarbital, (XIII)psilocybin, (XIV)temazepam

  47. MS–MS spektra amfetaminu a 3,4-MDMA

  48. Ap-OH-AP, Bp-OH-MA, Cnorefedrin D, efedrin, E AP; F 3,4-methylendioxyamfetamin (MDA), G 3,4-methylendioxymethamfetamin (MDMA), H MA, Imethoxyfenamin, J DMA. K dibenzylamin (I.S.)

  49. Rekonstruovaný iontový chromatogram (1)psilocybin (2)morfin (3)salbutamol (4)amfetamin (5)3,4-MDMA (6)clenbuterol (7)LSD (8) fenobarbital (9)buprenorfin (10)temazepam (11)nandrolon, (12)metandienon (13)testosteron (14)stanozolol

More Related