Vybrané metody ACh

1. Vybrané metody ACh KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE

2. Kapalinová chromatografie (LC) • Nejdéle známá chromatografická metoda (Cvět). Téměř 80% známých látek lze analyzovat pomocí LC (iontové, polární i nepolární, mol.hm. 5-106) • Papírová chromatografie (PC) je starší technika a byla postupně nahrazena tenkovrstevnou chromatografií (TLC). • Pro obě techniky je stacionární fáze umístěna v ploše. V případě PC je tvořena speciálním papírem, u TLC tenkou vrstvou fáze na desce (sklo, hliníková či plastová folie)

3. PC a TLC – stacionární fáze • V PC je stacionární fází voda sorbovaná na papíře • V TLC stejné materiály jako v kolonové chromatografii • Pro lipofilní – adsorbenty oxid hlinitý (alumina), silikagel, polyamid, acetylovaná celulóza • Pro hydrofilní – celulóza, měniče iontů, křemelina, polyamidy a chemicky vázané fáze • Desky pro TLC lze připravit v laboratoři, přednost se dává komerčně připraveným deskám pro klasickou TLC, HPTLC či preparativní TLC

4. PC a TLC – stacionární fáze • Vrstva fáze (0,1 -0,5 mm pro analytické a 0,5 -2,0 pro preparativní účely)je nanesena na skleněné, hliníkové nebo plastové desce. • Přilnavost k desce se zvyšuje přídavkem pojiva 0,1-10% (sádra, škrob, polyakrylová kyselina a její soli) • Pro snadnější vizualizaci skvrn se často přidává fluorescenční indikátor např. aktivovaný křemičitan hořečnatý o stejném zrnění (analyt zháší fluorescenci) • Někdy stacionární fázi na desce předchází tzv. koncentrační zóna (2-3cm) tvořená inertním sorbentem • Pro HPTLC se používají menší sférické částice (2-10μm)s jednotnou velikostí nebo monolitické ultratenké vrstvy – vysoká účinnost, délku lze zkrátit na několik cm, vyšší citlivost (pg)

5. PC – mobilní fáze • Jako mobilní fáze v PC se používají směsi rozpouštědel v závislosti na struktuře analytu. • Pro polární látky se často používají směsi butanol-kyselina octová (hydroxid amonný)-voda • Pro středně polární butylacetát, diisopropylether, chloroform s malým přídavkem polárních rozpouštědel a vody • Pro zcela nepolární látky papír impregnovaný parafinovým olejem a vodné roztoky alkoholů nasycené stacionární fází jako mobilní fáze (RP-PC).

6. TLC – mobilní fáze • O volbě mobilní fáze v TLC rozhoduje použitá stacionární fáze • Pro dělení na adsorpčním principu a chemicky vázaných fázích se volí rozpouštědla podle eluční schopnosti – eluotropní řady (n-pentan ,……., voda) • Pro měniče iontů elektrolyty • Pro gely voda nebo organická rozpouštědla

7. PC a TLC - vyvíjení • Vzorek se nanese ve formě malých skvrn na start pomocí mikropipetky, mikrostříkačky a nechá se odpařit rozpouštědlo • Uspořádání vzestupné, sestupné (PC), kruhové v komoře nasycené parami rozpouštědel – rozpouštědlo vzlíná kapilárními silami. V HPTCL deska v hermetické „komoře“ s kontrolovaným přetlakem • Vyvíjení • jednoduché (v jedné soustavě) • vícenásobné – aplikují se různé mobilní fáze, na čele nové mobilní fáze dojde k zakoncentrování • dvojrozměrné – skvrna se vyvine v jednom směru, deska se vysuší a otočí o 90° a vyvíjí se v jiné soustavě

8. PC a TLC – vyhodnocování kvality • Pokud nejsou dělené látky barevné, je nutno skvrny vizualizovat. • Postřik činidlem, nebo namočení do roztoku který poskytuje barevnou reakci (nespecifická – páry jódu, konc. kyselina sírová, acidobazické indikátory pro kyseliny a zásady, specifická pro funkční skupiny) • Pozorování v UV záření – fluorescence či její zhášení na deskách s indikátorem (254 nebo 366nm) • Základní veličina, která charakterizuje polohu separovaných zón je retardační faktor RF definovaný jako poměr vzdáleností, které urazil analyt di a čelo mobilní fáze dm RF = di/dm= ui/um = 1/(1+k) u – příslušné rychlosti, k- retenční faktor

9. PC a TLC – vyhodnocování kvality • Hodnota RF se pohybuje od 0 (látka nemigruje) do 1 (látka není zadržována a migruje s čelem rozpouštědla) • Hodnoty RF jsou špatně reprodukovatelné • Stacionární, mobilní fáze a páry nejsou v rovnováze • Kapilární síly záleží na průměru kanálků – průtok není konstantní • Látky se v PC a TLC vyhodnocují na základě RF hodnot a jejich shodě se standardy • Využívají se také hodnoty RM definované RM = log[(1/RF)-1 ]= log k hodnoty RM souvisejí se strukturou, v homologických řadách závisí lineárně na počtu strukturních jednotek • Pro kruhové vyvíjení platí RF,lineární =R2F,kruhový.

10. PC a TLC – vyhodnocování kvantity • Metody přímé • Měření plochy skvrny – logaritmus plochy je úměrný koncentraci • Radiochemické metody – radioaktivně značené látky • Denzitometrie – nejběžnější a nejpřesnější – skenovací fotodenzitometry převádějí intenzitu skvrn na chromatogram s píky, jejichž plocha je úměrná množství analytu • Nepřímá metoda – skvrna se vystřihne či vyškrábe a extrahuje a stanoví se koncentrace

11. Kolonová LC • V klasickém provedení v kolonách 500 x 10mm, částice 0,05-1,0 mm + hydrostatický tlak – málo účinné, dlouhá doba analýzy (hodiny) – dodnes pro preparativní a jednoduchá dělení • HPLC se vyvinula z GC na počátku 70. let. Vysoké účinnosti se dosahuje • Použitím malých částic (2-7μm) pravidelného tvaru a jednotné velikosti • Průtok mobilní fáze musí být zajištěn vysokým tlakem (jednotky – desítky MPa) • Lze zpracovávat malá množství (μl) • Potřeba citlivých detektorů náročná instrumentace

12. Srovnání GC x HPLC • Rozdíly • Podstatně menší částice (dp) – GC 0,1-0,3 mm x HPLC 0,01 – 0,003 mm • Podstatně vyšší viskozita a hustota mobilní fáze (Dm) • Aby bylo možno srovnávat zavedeny redukované veličiny

13. Kolony HPLC • Tradiční analytické náplňové kolony • délka 5-25 cm, • vnitřní průměr několik mm, • průtok mobilní fáze cca 1ml/min • objem vzorku 1-20 μl • částice náplně 5-10 μm, kulovitého tvaru Během používání při vysokých tlacích se náplň sesedá • Mikronáplňové • vnitřní průměr 1 mm a menší • částice 2-3 μm • Objem vzorku cca 1 μl • průtok mobilní fáze desítky μl/min Lze ještě používat běžnou instrumentaci

14. Kolony HPLC • Kapilární náplňové • Vnitřní průměr 0,15 – 0,5 mm • Částice 2 μm a menší • Průtok mobilní fáze 1-15 μl/min • Kapilární • Vnitřní průměr 10 μm • Průtok mobilní fáze cca 1 ml/min Vyžadují speciální instrumentaci (čerpadla, nl-dávkovače, detektory) • Čipová instrumentace (celý kapalinový chromatograf na čipu) – není dosud komerčně dostupná

15. Monolitické kolony • Kompaktnější náplň než klasické náplňové kolony • Kolona je vyplněna polymerem organického či anorganického původu o definované pórovitosti, který se vytvoří přímo v koloně vhodnou polymerační reakcí v roztoku • Monolitické kolony na bázi silikagelu mají vysokou pórovitost, která dovoluje vysoké průtoky a velký povrch pro interakce s analyty • Monolitické kolony mají větší životnost, velkou mechanickou stabilitu, jsou odolnější ke změnám pH a vykazují vysoké účinnosti při velkých průtocích mobilní fáze

16. Separační principy v LC • Adsorpční chromatografie s polárními sorbenty a nepolárními mobilními fázemi je historicky nejstarší – systém s normálními fázemi • Analyt soutěží o aktivní místa na povrchu adsorbentu s mobilní fází • Fyzikální adsorpce je charakterizována slabšími interakčními silami • Chemisorpce je nežádoucí • Silněji se sorbují polární látky • Sorpce je podporována nepolární mobilní fází

17. LSC • Při velkém zředění solutu lze adsorpční děj popsat lineární izotermou danou Henryho zákonem, při vyšších koncentracích (preparativní HPLC) sorpčními izotemami • Silikagel-polární sorbent (silanolové skupiny –SiOH) , siloxanové (Si-O-Si) jsou nežádoucí. Stabilní při pH 2-8 • Alumina – stabilnější v alkalickém prostředí (pH 2-12), vhodná pro látky bazického charakteru • Adsorbenty na bázi organických polymerů • Mobilní fáze nepolární rozpouštědla (hexan, heptan,..) s malým množstvím (do 1%) modifikátoru (voda, alkoholy, acetonitril, tetrahydrofuran) • Vhodná pro separaci látek lišících se funkčními skupinami a izomerů. Nevhodná pro dělení v homologických řadách.

18. LC na chemicky vázaných fázích • Chemicky vázané fáze (hlavně nepolární-reverzní) v součastné době nejpoužívanější • Umožňují aplikace pro analyty s širokým rozsahem polarity (80% všech aplikací) • Široký sortiment fází • Levné mobilní fáze a rychlé ustavování rovnováhy • Reverzní chromatografie je jednodušší, rychlejší a reprodukovatelnější • RP – umožňují přímé aplikace na biologické vzorky (vodné roztoky) • Nevýhody • Složitý retenční mechanizmus • Chemicky vázané fáze na silikagelu jsou stabilní v omezeném rozsahu pH (2,5-8) • Přítomnost nezreagovaných silanolových skupin vede k nežádoucí adsorpci a je příčinou kompllikovaného mechanizmu

19. LC na chemicky vázaných fázích • Silikagel je nejběžnějším nosičem pro chemicky vázané fáze – obsahuje silanolové skupiny, ve kterých může být aktivní vodík snadno nahrazen různými funkčními skupinami –R. Většina fází je siloxanového typu Si-O-Si-R • Reakcí s monochlororganosilany vznikají fáze s monomolekulární vrstvou vázané fáze, zatímco reakcí s di- a trichlorsilany dochází k sesíťování a vzniku polymerní vrstvy • v poslední době se používají i jiné materiály jako oxid zirkoničitý a titaničitý, které jsou stálé v širším rozsahu pH • Lze použít i polymerní nosiče, které jsou stálé v širokém rozsahu pH, neobsahují zbytkové aktivní skupiny, ale mohou uplatňovat hydrofobní a vylučovací efekty

20. LC na chemicky vázaných fázích RP – reversní fáze, NP – normální fáze SEC – vylučovací chromatografie

21. LC na chemicky vázaných fázích • Mechanizmus separace na reversních chemicky vázaných fázích je kombinací tří interakcí • Interakce solutu s mobilní fází (vodou) – rozhodující • Přídavkem organických rozpouštědel povrchové napětí vody klesá a klesá i retence • Přídavkem solí povrchové napětí roste a zvyšuje se i retence • Interakce mobilní fáze se stacionární fází - při větším obsahu organického rozpouštědla (nad 50%)jsou alkyly solvatovány a slut reaguje s celým řetězcem • Rozdělování solutu mezi mobilní a stacionární fázi – retence roste s množstvím vázaného uhlíku (10-60%) a délkou řetězce • Nejpoužívanější je oktadecylová fáze (RP C-18) • Lze separovat nepolární látky (voda + organická rozpouštědla) • Látky polarizovatelné a slabé kyseliny a báze (potlačit disociaci volbou pH) • Látky iontového charakteru, přidáme li do mobilní fáze iontově párové činidlo s opačným nábolem (laurylsulfát, tetraalkylamonné soli,..) – tvorba asociátu – iontově párová chromatografie

22. Iontově výměnná chromatografie • Jako stacionární fáze se používají • organické polymery • materiály na bázi silikagelu – jsou účinnější, rychleji se ustavuje rovnováha, umožňují práci s gradientovou elucí • Využívají s následující funkční skupiny • Karboxylová (-COOH) – slabý měnič kationtů • Sulfoskupiny (-SO3H) – silný měnič kationtů • Aminoskupina (-NH2) – slabý měnič aniontů • Tetraalkylamoniová (-N+(R)3) – silný měnič aniontů • Jako mobilní fáze se používají vodné tlumivé roztoky, jejichž ionty jsou v dynamické rovnováze s ionty měniče – čím větší koncentrace, tím rychlejší eluce

23. Iontově výměnná chromatografie • Retenci lze ovlivňovat • Koncentrací solí • Hodnotou pH • Teplotou • Přídavkem organického modifikátoru • Používá se pro • látky iontové povahy – silné i slabé elektrolyty • Aminokyseliny – fáze ze silného katexu a C-18 • Pro čištění peptidů a proteinů • některé neutrální látky lze převést na nabité ionty (komplexy diolů a cukrů s kyselinou boritou) • Speciální případ je iontová chromatografie na silných katexech či anexech s vodivostní detekcí. Aby byla detekce citlivá, je nutno potlačit vodivost mobilní fáze (uhličitany pro anionty a HCl pro kationty). Před detektor je zařazena potlačovací ionexová kolona opačného charakteru, která zamění disociovanou fázi za málo disociovanou- tedy málo vodivou.

24. Vylučovací chromatografie (SEC, GPC) • Molekuly se dělí podle své velikosti na základě vylučovacího nebo síťového efektu • Rozhodující úlohu hraje velikost a tvar solutu a velikost a tvar pórů stacionární fáze (gelu) • Jiné symboly pro retenční charakteristiky • Vi – objem mobilní fáze uvnitř pórů stacionární fáze • V0 – objem mobilní fáze mezi částicemi • Vt – celkový objem mobilní fáze v kolony Vt = V0 + Vi • Molekuly větší než objem pórů se nedostanou do stacionární fáze a eluují v objemu VR=V0 • Malé molekuly, které mohou pronikat všemi póry eluují v celkovém objemu mobilní fáze VR=Vt. • Ostatní látky eluují v retenčním objemu VR (V 0<VR<Vt)

25. Vylučovací chromatografie (SEC, GPC) • Frakce objemu uvnitř pórů dosažitelná pro difúzi solutu se nazývá distribuční konstanta K0 K0 = (VR-V0)/Vi  VR = V0 + K0Vi • Velké molekuly VR = V0 a tedy K0 = 0 • malé molekuly VR= Vt a K0 = 1 •  K0 (0 – 1) • Omezená separační kapacita (eluce mezi V0 a Vi). • Pro dosažení vyšší účinnosti separace nutno použít dlouhé kolony • V případě ideálního chování v SEC (o retenci rozhoduje jen velikost a tvar pórů sttacionární fáze a analytu), je retenční čas (objem) přímo úměrný logaritmu molekulové hmotnosti Mr tr = a – b log Mra,b - konstanty

26. Vylučovací chromatografie (SEC, GPC) • V případě ideálního chování v SEC (o retenci rozhoduje jen velikost a tvar pórů stacionární fáze a analytu), je retenční čas (objem) přímo úměrný logaritmu molekulové hmotnosti Mr tr = a – b log Mra,b – konstanty • Odchylky od ideálního chování jsou způsobeny interakcemi solutu se stacionární fází (iontová výměna, adsorpce, solvofobní interakce) Lze je někdy eliminovat složením mobilní fáze- přídavek organické fáze, solí

27. Vylučovací chromatografie (SEC, GPC) • Stacionární fáze • V klasické gelové chromatografii se používají hydrofilní zesíťované agarosové a dextranové gely – bobtnají a jsou stlačitelné – nelze používat v HPLC • Pro HPLC semirigidní a rigidní náplně na bázi styren-divinylbenzenového kopolymeru nebo methakrylátových polymerů • Pro biopolymery – hydrofilní polymery nebo anorganické stacionární fáze (porézní sklo, silikagel) – nebezpečí adsorpce solutů a složek mobilní fáze • Mobilní fáze by neměla vykazovat interakce s analyty ani stacionární fází • Musí rozpouštět analyty (vyšší pracovní teplota) • Musí dobře smáčet povrch stacionární fáze, ale nesmí s ní interagovat • Nemá solvatovat soluty – zvýšení jejich zdánlivé molekulové hmotnosti • Kompatibilní s detektorem (pro UV nelze používat aromáty)

28. Vylučovací chromatografie (SEC, GPC) • SEC se využívá hlavně pro vysokomolekulární látky v polymerní chemii a biochemii s molekulovou hmotností nad 2 000. • Pro předseparaci komplexních vzorků (štěpných produktů proteinů s tripsinem) • Oddělení nízkomolekulárních látek od vysokomolekulárních (gelová filtrace) • Určení molekulové hmotnosti látek a její distribuce

29. Afinitní (biospecifická) chromatografie • Je založena na silných biospecifických interakcích analytů s komplementárními látkami (ligandy) – interakce enzymů s inhibitory, substráty,kofaktory či efektory, komplexy protilátek s antigeny atd. • Stacionární fáze- nosič s kovalentně navázaným ligandem (afinantem) • Na takovou fázi se ze vzorku zadrží pouze látky s komplementární vazbou, ostatní se eluují s mrtvým časem • Analyt se z vazby na ligand uvolní změnou pH, koncentrace solí, změnou teploty, přídavkem činidel

30. Volba separačního systému

31. Instrumentace v HPLC

32. Čerpadla • Pro kapilární kolony nl/min • Pro mikronáplňové μl/min

33. Čerpadla • Pro běžné náplňové kolem 1ml/min • Pro preparativní desítky ml/min

34. Gradient mobilní fáze • Odplyněné mobilní fáze přes filtr • Snížený tlak • Ultrazvuk • Probublávání heliem

35. Dávkování

36. Spektrofotometrické detektory

37. Fluorescenční detektor

38. Refraktometrický detektor

39. Refraktometrický detektor

40. Detektory pro HPLC • Detektor založený na rozptylu světla s odpařením mobilní fáze (ELS – evaporative light scattering detektor) . Použití je omezeno na netěkavé analyty a těkavé mobilní fáze – universální detektor • Elektrochemické detektory (aminy, fenoly, …) • Měření vodivosti pro iontové látky • Měření elektrického proudu elektrochemického děje (oxidace, redukce) • Pracovní elektrody • Ušlechtilý kov Au, Pt • Různé formy uhlíku pro oxidace • Rtuť a rtuťový film pro redukce • Spojení s AAS, IPC, AES, NMR, MS

41. Gradientová eluce • Během analýzy se mění složení mobilní fáze. Používá se pro vzorky s velkými rozdíly v retenčních faktorech (10 < k < 1)