Guillaume Lamour Directeur de thèse : Ahmed Hamraoui 24/06/2010

1. Soutenance de thèse Influence de la nanostructuration énergétique des substrats dans l’adhésion et dans la différenciation des cellules neuronales modèles PC12 Guillaume Lamour Directeur de thèse : Ahmed Hamraoui 24/06/2010

2. Différenciation neuronale : processus suivant lequel une cellule acquiert un phénotype neuronal

3. Interactions [neurones/surfaces biocompatibles] • Différenciation neuronale et adhésion cellulaire : • Comment les cellules interagissent avec des surfaces ? • Quels sont les mécanismes intracellulaires induits par l’adhésion à des substrats ? • Différenciation neuronale et adhésion cellulaire : • Comment les cellules interagissent avec des surfaces ? • Quels sont les mécanismes intracellulaires induits par l’adhésion à des substrats ? • Différenciation neuronale et adhésion cellulaire : • Comment les cellules interagissent avec des surfaces ? • Quels sont les mécanismes intracellulaires induits par l’adhésion à des substrats ? neurite cône de croissance noyau corps cellulaire (soma)

4. Le cône de croissance : structure et fonctions faisceau de filaments d’actine chimio-attraction chimio-répulsion filament d’actine microtubule filopode lamellipode cône de croissance axone

5. Interactions [neurones/surfaces biocompatibles] • Adhésion cellulaire et différenciation neuronale : • Comment les cellules interagissent avec des surfaces ? • Quels sont les mécanismes intracellulaires induits par l’adhésion à des substrats ? • Propriétés de surface des biomatériaux : • La neuritogénèse peut-elle être contrôlée par des paramètres d’adhésion ? • Quelle stratégie de modification du matériau peut favoriser la neuritogénèse ? • Propriétés de surface des biomatériaux : • La neuritogénèse peut-elle être contrôlée par des paramètres d’adhésion ? • Quelle stratégie de modification du matériau peut favoriser la neuritogénèse ? • Propriétés de surface des biomatériaux : • La neuritogénèse peut-elle être contrôlée par des paramètres d’adhésion ? • Quelle stratégie de modification du matériau peut favoriser la neuritogénèse ? Deux paramètres : Nanorugosité Gradients locaux ΔE E2 E5 E4 Distribution de l’énergie de surface E3 E1 1 µm 1 µm ? surface

6. Partie I Influence de la distribution des énergies d’adhésion sur la neuritogénèse

7. Plan de l’exposé • Introduction • Partie I • Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse •  Stratégies de modification des surfaces de verre • Caractérisation de l’état de différenciation • Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat • Partie II • Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire •  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH3  » •  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH2 » •  Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule • Conclusion

8. Technique de modification du verre

9. Stratégies de modification du verre par diverses molécules PLL n EDA

10. Cellules PC12 : modèle d’étude pour la différenciation neuronale • Les cellules PC12 : • sont dérivées d’un phéochromocytome de rat. • voient leur cycle cellulaire stoppé et se différencientsous traitement auNGF. • Les cellules PC12 : • sont dérivées d’un phéochromocytome de rat. Cellule PC12 - 6 jours Cellules PC12 - à l’ensemencement Cellule PC12 NGF 6 jours

11. Neuritogénèse des cellules PC12 sous l’effet d’un traitement au NGF avecNGF sans NGF 6 jours 6 jours

12. Neuritogénèse induite par effet de surface Sur PLL : Sur EDA : sans NGF sans NGF verre/EDA 6 jours 6 jours 6 jours Gradients locaux dans les énergies d’adhésion

13. Plan de l’exposé • Introduction • Partie I • Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse •  Stratégies de modification des surfaces de verre • Caractérisation de l’état de différenciation • Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat • Partie II • Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire •  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH3  » •  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH2 » •  Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule • Conclusion

14. Expression du marqueur neuronal : MAP1B

15. Immunomarquage de MAP1B (après 6 jours de culture) verre/PLL sans NGF témoin négatif verre/PLLavec NGF témoin positif verre/EDA sans NGF

16. Expression du marqueur neuronal : Tau actine Tau ADN PEDA :6 jours (sans NGF) avec NGF sans NGF PEDA : 6 jours 50 µm 50 µm 25 µm 50 µm

17. Plan de l’exposé • Introduction • Partie I • Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse •  Stratégies de modification des surfaces de verre • Caractérisation de l’état de différenciation • Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat • Partie II • Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire •  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH3  » •  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH2 » •  Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule • Conclusion

18. Influence de la nature des terminaisons Biopolymères (acides aminés) Alkylsiloxanes NH2 NH3+ PLL EDA CH3 NH2 PLO HTMS peu ou pasde neuritogénèse neuritogénèse élevée

19. Microscopie interférentielle (RICM) temps accéléré (× 50) EDA PLL 10 µm HTMS PLO

20. Conclusions • Neuritogénèse obtenue par effet de surface • Expression de marqueurs neuronaux • Influence de gradients locaux dans les énergies d’adhésion  Reproduction de l’effet du NGF Limites • Comparaison alkylsiloxanes / biopolymères • Conditions de culture pas optimales • Multiplicité des paramètres : • mouillabilité, nanorugosité, distribution des terminaisons ↔ degré d’hétérogénéité chimique •  Nécessité d’améliorer le contrôle afin d’identifier les paramètres critiques • Comparaison alkylsiloxanes / biopolymères • Conditions de culture pas optimales • Multiplicité des paramètres : • mouillabilité, nanorugosité, distribution des terminaisons ↔ degré d’hétérogénéité chimique •  Nécessité d’améliorer le contrôle afin d’identifier les paramètres critiques • Comparaison alkylsiloxanes / biopolymères • Conditions de culture pas optimales • Multiplicité des paramètres : • mouillabilité, nanorugosité, distribution des terminaisons ↔ degré d’hétérogénéité chimique •  Nécessité d’améliorer le contrôle afin d’identifier les paramètres critiques • Comparaison alkylsiloxanes / biopolymères • Conditions de culture pas optimales • Multiplicité des paramètres : • mouillabilité, nanorugosité, distribution des terminaisons ↔ degré d’hétérogénéité chimique •  Nécessité d’améliorer le contrôle afin d’identifier les paramètres critiques  Influence de facteurs externes

21. Partie II Identification des paramètres de surfaces critiques à la réponse cellulaire

22. Plan de l’exposé • Introduction • Partie I • Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse •  Stratégies de modification des surfaces de verre • Caractérisation de l’état de différenciation • Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat • Partie II • Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire •  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH3  » •  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH2 » •  Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule • Conclusion

23. Modification du verre par auto-assemblage d’alkylsiloxanes très désordonnée hétérogénéité chimique accrue très ordonnée conformation all-trans partiellement ordonnée perte des liaisons latérales Classe 2 Classe 3 Classe 1

24. État virtuel ωVis ωSFG ωIR État fondamental Techniques de caractérisation des surfaces modifiées • Spectroscopie vibrationnelle : • génération de fréquence somme (SFG) État vibrationnel excité substrat • Mesure d’angles de contact et estimation des énergies libres des surfaces solides : • modèle Owens-Wendt énergie d’adhésion solide-liquide composantes dispersive/apolaire composantes non-dispersive/polaire

25. Comparaison IRTF / SFG sur le spectre vibrationnel d’une monocouche d’OTS (région C-H)

26. Spectres SFG des substrats dans la région C-H HTMSH(θ= 104°) OTS(θ= 110°) ODMS2(θ = 96°) ODMS1(θ = 77°) HTMSM(θ = 56°) OTS ; HTMSH : Formation d’une monocouche très ordonnée Classe 1 ODMS1 ; ODMS2 ;HTMSM : Formation d’une monocouche désordonnée Classe 2 & Classe 3

27. État virtuel ωVis ωSFG ωIR État fondamental Techniques de caractérisation des surfaces modifiées • Spectroscopie vibrationnelle : • génération de fréquence somme (SFG) substrat État vibrationnel excité • Mesure d’angles de contact et estimation des énergies libres des surfaces solides : • modèle Owens-Wendt énergie d’adhésion solide-liquide composantes dispersive/apolaire composantes non-dispersive/polaire

28. Estimation des énergies libres de surface Classe 1 (¤) : Distribution homogène de l’énergie (s≈ d ) Classe 2 (▲) : présence de gradients locaux dans les Eadhésion Classe 3 (#) :  hétérogénéitéschimiques accrues

29. Adhésion et neuritogénèse des PC12 sur 3 classes de surfaces après 48h de culture sans NGF classe 1 classe 2 classe 3 surface très ordonnée surface (dés)ordonnée surface très désordonnée pas d’adhésion  agrégats cellulaires flottant adhésion limitée  quelques neurites adhésion renforcée  forte croissance neuritique 200 µm 200 µm 200 µm Adhésion limitée sur le verre propre (les cellules tendent à se détacher)

30. Conclusions • Identification du facteur critique : •  hétérogénéités chimiques aux échelles nanométriques • Eadhésion(classe 3) > Eadhésion(classe 2) : quelle est l’influence du γs ? • Identification du facteur critique : •  hétérogénéités chimiques aux échelles nanométriques • Eadhésion(classe 3) > Eadhésion(classe 2) : quelle est l’influence du γs ?

31. Plan de l’exposé • Introduction • Partie I • Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse •  Stratégies de modification des surfaces de verre • Caractérisation de l’état de différenciation • Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat • Partie II • Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire •  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH3  » •  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH2 » •  Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule • Conclusion

32. Modification du verre par des aminosilanes Monométhoxy-silane Triméthoxy-silanes DETA PEDA ADMS APTMS EDA État désordonné Classe 2 État ordonné Classe ???

33. Analyses des surfaces NH2 : théorie de Zisman Liquides tests • eda & peda : • très hétérogènes (Classe 3) • adms & aptms : • plus homogènes (Classe 2) • deta : ??? ADMS APTMS énergies critiquesγc EDA PEDA ± 2 mN m-1

34. Analyses des surfaces NH2 : théorie de Owens – Wendt Liquides tests • eda & peda : • très hétérogènes (Classe 3) • adms & aptms : • plus homogènes (Classe 2) • deta : ??? ADMS APTMS énergies critiquesγc ± 2 mN m-1

35. Cellules en culture sur les surfaces NH2/OH après 24h de culture sans NGF cas particulier du deta classe 2 classe 3 différenciation : ++++ différenciation : + classe 2

36. Conclusions • La réponse cellulaire est similaire entre les surfaces NH2/OH et les surfaces CH3/OH. • L’intensité de la tension de surface totale γs n’est pas critique. • Sur des surfaces homogènes (CH3, NH2, ou OH) : l’adhésion est modulée par le degré d’affinité chimique des cellules au substrat, • et la différenciation n’est pas stimulée. • Sur des surfaces hétérogènes : l’adhésion est garantie quelle que soit le couple de groupes chimiques (NH2/OH ou CH3/OH) produisant l’hétérogénéité, • et la différenciation est fortement stimulée. • La réponse cellulaire est similaire entre les surfaces NH2/OH et les surfaces CH3/OH. • L’intensité de la tension de surface totale γs n’est pas critique. • Sur des surfaces homogènes (CH3, NH2, ou OH) :l’adhésion est modulée par le degré d’affinité chimique des cellules au substrat, • et la différenciation n’est pas stimulée. • Sur des surfaces hétérogènes : l’adhésion est garantie quelle que soit le couple de groupes chimiques (NH2/OH ou CH3/OH) produisant l’hétérogénéité, • et la différenciation est fortement stimulée. • La réponse cellulaire est similaire entre les surfaces NH2/OH et les surfaces CH3/OH. • L’intensité de la tension de surface totale γs n’est pas critique. • Sur des surfaces homogènes (CH3, NH2, ou OH) : l’adhésion est modulée par le degré d’affinité chimique des cellules au substrat, • et la différenciation n’est pas stimulée. • Sur des surfaces hétérogènes :l’adhésion est garantie quelle que soit le couple de groupes chimiques (NH2/OH ou CH3/OH) produisant l’hétérogénéité, • et la différenciation est fortement stimulée.

37. Plan de l’exposé • Introduction • Partie I • Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse • Stratégies de modification des surfaces de verre • Caractérisation de l’état de différenciation • Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat • Partie II • Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire •  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH3  » •  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH2 » •  Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule • Conclusion

38. AFM : cellules PC12 sur verre/EDA. 150 nm

39. Déstabilisation du cytosquelette d’actine par la cytochalasine-B. témoin [cytochalasine] = 5 µM

40. Conclusion générale. • Influence de la distribution des énergies d’adhésion sur la différenciation neuronale •  Mise en évidence de l’impact de gradients locaux • Redéfinition des monocouches auto-assemblées en qualité de substrat d’adhésion selon la distribution des énergies de surfaces qu’elles exposent •  Classe 1 : très ordonnée • Classe 2 : relativement (dés)ordonnée • Classe 3 : très désordonnée • Nécessité de combiner SFG et Owens – Wendt •  Assignation des substrats élaborés aux classes définies • Mise en évidence de l’influence des hétérogénéités chimiques locales du substrat dans les processus d’adhésion et de différenciation neuronale des cellules PC12

41. Perspectives • Comment la cellule détecte-t-elle les gradients locaux dans les énergies d’adhésion ? •  Investigation de la dynamique des filaments d’actine • A partir de quelle dimension exacte les gradients locaux sont-ils critiques à la réponse cellulaire ? •  Création de gradients contrôlés via des nanoplots • Quels sont les médiateurs de la transmission des gradients locaux à la cellule ? •  Examen du rôle éventuel de l’ion Ca2+ • Comment la cellule détecte-t-elle les gradients locaux dans les énergies d’adhésion ? •  Investigation de la dynamique des filaments d’actine • A partir de quelle dimension exacte les gradients locaux sont-ils critiques à la réponse cellulaire ? •  Création de gradients contrôlés via des nanoplots • Quels sont les médiateurs de la transmission des gradients locaux à la cellule ? •  Examen du rôle éventuel de l’ion Ca2+ • Comment la cellule détecte-t-elle les gradients locaux dans les énergies d’adhésion ? •  Investigation de la dynamique des filaments d’actine • A partir de quelle dimension exacte les gradients locaux sont-ils critiques à la réponse cellulaire ? •  Création de gradients contrôlés via des nanoplots • Quels sont les médiateurs de la transmission des gradients locaux à la cellule ? •  Examen du rôle éventuel de l’ion Ca2+ • Comment la cellule détecte-t-elle les gradients locaux dans les énergies d’adhésion ? •  Investigation de la dynamique des filaments d’actine • A partir de quelle dimension exacte les gradients locaux sont-ils critiques à la réponse cellulaire ? •  Création de gradients contrôlés via des nanoplots • Quels sont les médiateurs de la transmission des gradients locaux à la cellule ? •  Examen du rôle éventuel de l’ion Ca2+

42. Conclusion générale. Distribution de l’énergie de surface Distribution de l’énergie de surface ?