Polymerase Chain Reaction

1. Polymerase Chain Reaction PCR

2. Geyser en el Parque Nacional de Yellowstone Thermophilus aquaticus

3. La base teórica de la reacción en cadena de la polimerasa o PCR fue expuesta en 1971 (Kleppl et al.), pero esta técnica no produjo demasiado interés hasta mediados de los años 80 • Fue desarrollada por Mullis y colaboradores a mediados de la década del ochenta (Saiki et al., 1985; Mullis y Falcona, 1987). • Procedimiento in vitro rápido que simula la replicación del ADN in vivo

4. Consiste en la amplificación de un segmento específico de ADN mediante un proceso enzimático • El resultado son múltiples copias de segmentos específicos de ADN • La técnica de PCR aprovecha las propiedades de desnaturalización y renaturalización del ADN • Provoca, en forma artificial, un aumento y descenso alternado de la temperatura (ciclos) del cóctel de reacción, por medio de un ciclador térmico o termociclador.

5. En el cóctel de reacción, se encuentran todos los elementos necesarios para la replicación ADN templado: segmentos de ADN doble cadena a ser amplificado Primers: oligonucleótidos simple cadena que flanquean los segmentos a amplificar. Son secuencias de ADN ADN polimerasa: la polimerización es conducida por una ADN polimerasa llamada Taq polimerasa obtenida de bacterias termófilas (Thermus aquaticus). Su temperatura óptima de catalización a 72 °C. Deoxyribonucleótidos trifosfato: (dNTPs)

6. Ciclos de reacción • Primer parte del ciclo • Aumento de la temperatura hasta 95 °C, • Produce la desnaturalización del ADN, es decir la separación de las dos hebras de la doble hélice. • Segunda parte del ciclo • Desciende la temperatura • Unión de los primers o annealing, que actúan como cebadores para el inicio de la replicación. • La temperatura de annealing de los primers (35 y 60 °C) depende del largo y la secuencia de los primers

7. Ascenso de la temperatura hasta 72°C y se mantiene 1-2 minutos para que la Taq pol realice la polimerización • Comienza un nuevo ascenso de temperatura • Se detiene la replicación • Al llegar a los 95°C se produce nuevamente la separación de las cadenas de ADN.

8. El resultado final es que luego de un determinado “n” número de ciclos en el tubo de reacción existirán 2n copias de la cadena de ADN por cada cadena de ADN blanco existente al comienzo de la reacción. • ciclo 1  2 copias nuevas de la cadena de ADN, complementarias a las cadenas molde • ciclo 2  4 copias • ciclo 10  1.024 copias • ciclo 20  1.048.576 • ciclo 30  1.073.741.824

9. Reacción de PCR

10. Condiciones a ajustar en una reacción de PCR  Condiciones de los primeros ciclos  determina la eficiencia de la unión del primer y el resultado de los siguientes ciclos •  Diseño de los primers • Secuencia: depende de la aplicación. No deben ser autocomplementarias (autoannealing) • Longitud: según la aplicación  Concentración de primers y componentes de reacción  Evitar contaminaciones  plásmidos, ADNs, células epiteliales

11.  Temperatura de annealing  largo y %G+C Si se usan dos primers, debe ser lo más parecida posible  Concentración de Mg++  cofactor de la Taq pol  °T 3 µM Reacción de de ajuste de PCR específica con el primer UMC85 en maíz Calle 1: Marcador de peso Calle 2: Blanco 2 µM 1 µM

12. Aplicaciones basadas en la reacción de PCR • PCR específica • RAPD • Microsatélites

13. PCR específica • Dos tipos de primers • longitud mayor a los 18 nucleótidos • contenido de G+C entre 40 y 60 % • Diseñados para amplificar secuencias específicas • Es conveniente que la temperatura de annealing de ambos primers sea la misma pero si no es así, se debe elegir la menor temperatura de annealing. • Se resuelve en gel de agarosa y es teñido con bromuro de etidio • Detección de secuencias específicas

14. RAPD • Utiliza un solo tipo de primer con secuencia al azar • El primer es de aproximadamente 9-10 b con G+C 50-80 % • Se conoce la secuencia del primer pero no la secuencia de ADN blanco que amplifica • Se obtiene un patrón de bandas característico de cada genotipo • Se resuelve en gel de agarosa con bromuro de etidio • Fingerprinting, distancias genética

15. RAPD • RAPD de 4 plantas de una población de alfalfa con dos primers RAPD en cebadilla criolla de dos poblaciones (2 bulks de 10 plantas) con los primers OPC6 y OPB8 

16. Diferenciación de regenerantes de anteras por RAPD

17. Comparación entre PCR y RAPD

18. Diferencias entre RAPDs y RFLPs

19. Microsatélites • Son pequeños segmentos de ADN cuya secuencia consiste en repeticiones en tandem de di, tri o tetra nucleótidos. • Los arreglos más frecuentes son: Dinucleótidos Trinucleótidos Plantas Animales Plantas AT 74% 13% TAT 27% AG/TC 24% 31% TCT 25% AC/TG 1% 56% CG 0% 1% • Resolución en agarosa o policrilamida y tinción con nitrato de plata o radiactiva

20. Primers de 10-15 nucleótidos Específicos del locus a ambos lados del tandem • Somáticamente estables y de transmisión mendeliana • Fingerprinting, mapeo y aplicaciones relacionadas

21. AFLP Amplified Fragment Length Polymorphisms • Es una combinación de las técnicas de RFLP y PCR • Basada en la detección de fragmentos de restricción por amplificación selectiva por PCR

22. Etapas de la técnica 5´ GAATTC TTAA 3´ 3´ CTTAAG AATT 5´ EcoRI EcoRI 5´ AATTC T 3´ 3´ G AAT 5´ EcoRI MseI MseI MseI • Digestión simultánea del ADN con dos enzimas de restricción EcoRI + MseI Se generan tres tipos de fragmentos de restricción

23. 5´ CTCGTAGACTGCGTACC 3´ CATCTGACGCATGG TTAA 5´ GACGATGAGTCCTGAG 3´ TACTCAGGACTC AT TA AATTC T TTAA G AAT • Ligación de los adaptadores Los extremos cohesivos dejados por el corte de las enzimas de restricción se ligan a pequeños oligonucleótidos Adaptador MseI Adaptador de EcoRI

24. Preamplificación selectiva o PCR +1 Se utilizan primers complementarios a los adaptadores que poseen en el extremo 3' una base nucleotídica más elegida al azar 5´GACTGCGTACC AATTCN 5´GATGAGTCCTGAG TAAN AATTC T TA NAAT AATTCN Amplificación TTAAG AAT Amplificación Primer + 1 EcoRI Primer + 1 MseI

25. Amplificación selectiva o PCR +3 • Amplificación selectiva de los fragmentos del ADN ligado a los adaptadores y luego amplificados en la preamplificación (PCR+1). • Se utilizan primers cuya secuencia posee en el extremo 3' dos bases nucleotídicas más (elegidas al azar) que el primer utilizado en la preamplificación, tres en total. Primer +3 EcoRI Primer + 3 MseI 5´GACTGCGTACC AATTC NNN 5´GATGAGTCCTGAG TAA NNN

26. Esquema general de la técnica de AFLP

27. Gel de AFLP

28. Análisis de la información de los perfiles de bandas • Análisis estadístico del perfil de bandas • Clasificación del perfil de datos o caracteres a analizar • Cálculo de las distancias genéticas entre pares de genotipos • La suma de las relaciones genéticas en el total de genotipos, permiten estimar el grado de parecido entre los genotipos

29. Genotipo A 1,1 1,0 Genotipo B 0,1 0,0 • Las bandas generadas por los marcadores determinan solo dos fenotipos:presencia o ausencia de banda • Las combinaciones posibles al comparar dos genotipos son:

30. A B C D E F G 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 2 0 0 0 0 1 1 0 3 4 1 1 1 1 0 1 1 5 0 0 1 0 1 0 1 • Ejemplo:

31. Coeficientes de Asociación A 1,00 B 0,67 1,00 0,25 0,50 1 C D 1 0,67 0,25 1 E 0 0 0,25 0 1 F G • Índice de Nei y Li (1979) • Índice de Jaccard (1908) A B C D E F G 0,67 0,50 0,20 0,67 0,25 1 0,67 0,50 0,50 0,67 0,25 0,50 1

32. Fenograma