Mohamed. M. Abou Auda, Lazaros Symeonidis, Evangelos Hatzisavrou, Traianos Yupsanis.

1. Nucleolytic activities and appearance of new DNase in relation to nickel and manganese accumulation in Alyssum murale. Mohamed. M. Abou Auda, Lazaros Symeonidis, Evangelos Hatzisavrou, Traianos Yupsanis. Department of Botany, School of Biology, Aristotle University, Greece Laboratory of Biochemistry, School of Chemistry, Aristotle, University, Greece

2. Introducción El Ni fue establecido como micronutriente escencial para el crecimiento de las plantas superiores y el Mn es fundamental para la oxidación fotosintética del H2O, así como también, para las enzimas reductasas dependientes de Mn. La absorción de cantidades fitotóxicas de un metal puede resultar en la inhibición de muchas enzimas involucradas en la fotosíntesis o en la activación de otras relacionadas con el Ciclo de Krebs. Existen plantas que por su capacidad de retener grandes cantidades de metales han sido clasificadas como hiperacumuladoras. Ej: Alyssum murale. Se cultivan en suelos contaminados con metales tóxicos (Cd, Pb, Zn, y más recientemente el Ni) para remover estos del suelo y poder explotarlos económicamente.

3. En este trabajo... • Estudio de dos poblaciones de Alyssum murale cultivadas en suelos serpentina y no serpentina atendiendo a: • Acumulación de Ni, Mn, Ca, Mg, K, Fe, de acuerdo con las características del suelo (entorno natural). • Acumulación de Ni y Mn bajo condiciones controladas con incrementos en la concentración de estos (solución nutriente Hoagland) • Efecto de la concentración del Ni y el Mn en: • crecimiento de las plantas. • Concentración de clorofila. • Actividad aparente de enzimas nucleolíticas.

4. Materiales y Métodos Colección de semillas, plantas y suelo de dos regiones metalíferas diferentes del norte de Grecia Vavdos (suelo serpentina rico en Ni) Grammeni (suelo no serpentina rico en Mn) Crecimiento de las plantas bajo condiciones controladas La germinación de las semillas y crecimiento de las plantas se produjo en cámara de crecimiento con 16h de luz (22±1°C, 65±3% HR) y 8h de oscuridad (19±1°C, 75±3% HR) Las semillas se montaron en una malla de nylon flotante en solución nutriente Hoagland modificada (Ouzounidou y col. 1994). Las soluciones se cambiaron cada 2 días. El Ni y el Mn se suplementaron como NiSO4 x 6H2O y MnSO4 x H2O, respectivamente. (0, 0.16, 0.32, 0.5 y 1 mmol/L) Los muestreos se realizaron a los 10, 13, 16 y 19 días.

5. Tolerancia a metales Se empleó como medida de la tolerancia, la inhibición del crecimiento de las raíces (Wilkins 1957) Determinación de la concentración de metales Las raíces se secaron en horno a 80°C y las muestras de tallos y suelo fueron digeridas en una mezcla de HNO3/HClO4 (4:1) La concentración de los metales se midió por Espectrofotometría de Absorción Atómica . Determinación de la concentración de clorofila Se midió clorofila a, b y a+b en los tallos, al 19 día. (Jeffrey y Humphrey, 1975). Extracción de enzimas nucleolíticas Los tallos y raíces congelados se maceraron en 15mL/g de buffer (200mmol/L de KH2PO4-K2HPO4) pH 6.5, PVPP 10%. Las muestras se diluyeron en 200 mmol/L de KH2PO4-K2HPO4para usarlas como fuente de enzima.

6. Determinación de Proteínas (Bradford modificado por Bearden, 1978) Ensayos enzimáticos La actividad DNasa y RNasa se realizó a 37°C, en un volumen final de 0.5mL en presencia de 0.6 mg/mL de sustrato (AND simple cadena y ARN), 33mmol/L de acetato de amonio pH 5.5, 1mmol/L de Zn y 33 mmol/L de tris acetato pH 7.5, 1mmol/L de Ca. La reacción se detuvo con la adición de un volumen igual de HClO4 12.5% frío. Los sustratos no degradados se separaron por centrifugación (4°C, 10 min, 12500 g) y se midió la absorvancia del sobrenadante a 260 nm. La actividad DNasa sobre el plásmido pTZ18R se realizó a pH 7.5 en precencia de 1 mmol/L de Ca, incubando 0.1 u de DNasa (Christou y col. 1997). Los productos de la reacción se analizaron por electroforesis en gel de agarosa teñido con 2 μg/mL de bromuro de etidio. Electroforesis en gel de poliacrilamida Detección de las isoformas de DNasa y RNasa (Kefalas y Yupsanis, 1995). A partir de aquí se realizó la extracción del fragmento del gel que correspondía a la DNasa para incubarla con el plásmido.

7. Resultados • Crecimiento de las plantas bajo condiciones controladas • Las semillas de ambos suelos acumularon tanto Ni como Mn, en correlación positiva con las concentraciones adicionadas en la solución nutriente. • Ocurrió acumulación de ambos iones más en los tallos que en las raíces. • Correlación negativa entre las concentraciones de Ni y Mn en la solución nutriente y la concentración de macro y micronutrientes en ambas poblaciones. • Tolerancia a metales • Ambas poblaciones presentaron síntomas de toxicidad para las concentraciones de Ni y Mn en la solución nutriente (acortamiento de la raíz y de la longitud del tallo, día 19, 0.5 mmol/L)

8. Determinación de la concentración de metales • El suelo de Vavdos mostró características típicas de suelo serpentina: alta [Ni] y [Mg], muy baja Ca/Mg, altas [Fe]. • El suelo de Grammeni mostró altas [Mn], [Fe] y especialmente [Ca], muy alta Ca/Mg. • Las plantas del suelo serpentina acumularon Ni tanto en raíces como en tallos, aunque las concentraciones fueron más bajas en raíces. • Las plantas del suelo no serpentina (rico en Mn) no fueron capaces de acumular Mn. • Determinación de la concentración de clorofila • La concentración de Mn (0.5mmol/L) redujo la concentración de clorofila (a, b, a+b), para ambas poblaciones, en un 50%. • Similar concentración de Ni redujo más la concentración de clorofila de la población del suelo no serpentina, mientras que en la población del suelo serpentina se incrementó ligeramente al inicio (0.16 y 0.32 mmol/L) y luego se comportó muy similar al control (permanece sin ser explicado)

9. Ensayos enzimáticos • Laactividad DNasa en tallo y raíz, para ambas poblaciones, disminuyó significativamente por la adición de 0.5 mmol/L de Ni y Mn, el día 9 y posteriormente se comportó muy similar al control. • La curva de la actividad RNasa en tallo y raíz mostró casi el mismo patrón que el control, para ambas poblaciones. • Se confirmó la naturaleza endonucleolítica de la DNasa de A. murale mediante la digestión del plásmido pTZ18R con la DNasa extraída del gel de poliacrilamida (corte lineal y degradación de la molécula circular de ADN) • Electroforesis en gel de poliacrilamida • El patrón para DNasa de raíz y tallo de ambas poblaciones mostró 4 isoformas (a, b, c y d) comunes para todo el crecimiento. • Aparece una nueva isoforma para 0.5 mmol/L a los días 19 (raíz), del 16 al 19 (tallo) y desaparece para 1mmol/L de Ni y Mn. • La intensidad de las bandas en tallo (medida de la actividad enzimática) fue casi la misma durante todo el crecimiento. • La intensidad de las bandas en raíz fue muy fuerte para a y d, mientras que para b y c fue débil.

10. Electroforesis en gel de poliacrilamida • Los patrones para las RNasas de raíz y de tallo fueron diferentes. • Las bandas mostraron diferentes intencidades a lo largo del crecimiento. • No se detectaron nuevas isoformas en ninguna de las poblaciones estudiadas

11. Conclusiones • Aunque las plantas de A. murale de ambas poblaciones son acumuladoras de metales, pueden presentar toxicidad ante concentraciones elevadas de Ni y Mn. • El Ni y/o Mn pueden provocar déficit de macro y micronutrientes (probablemente por competencia). • Se produjo mayor acumulación de metales en el tallo. • El Mn puede provocar alteraciones más graves que el Ni sobre la síntesis de clorofila. • Los metales disminuyen la actividad nucleolítica de las DNasas mientras que las RNasas parecen no afectarse. • La DNasa de A. murale se comporta como una endonucleasa. • Tanto el número de isoformas como la actividad de las nucleasas (intencidad de las bandas) varía de acuerdo a los niveles de metales en el suelo, así como también a la edad de las plantas.