SPEKTROFOTOMETRİ

1. Kuadropol kütle spektrometresi (QMS), gaz kromatografisi(GC) ayarlanabilir lazer spektrometresi (TLS)

2. SPEKTROFOTOMETRİ ANALİTİK KİMYA II

3. Işık-madde ilişkisi Maddelerin absorpladığı ışığın ölçümüne dayanan yönteme spektrofotometri denir. X → X* Işık: foton, dalga, ikili model hν Temel hal Uyarılmış hal

4. Işığın özellikleri • (lambda);(dalgaboyu, m) sinusoidalbirdalgahareketindebirbirinitakipedenikiminimumveyaikimaksimumarasındakimesafedir, • (nü)(frekans; sn–1) bir noktadan saniyede geçen dalga sayısı E = h .  h (Plancksabiti) = 6.62 10–27 erg.sn, Frekansiledalgaboyuarasında = c / şeklindebirbağıntıvardır. c(ışıkhızı): 3x1010 cm/sn E = h (c / ) (dalga sayısı, cm–1)= 1 /  Belirli bir birim mesafedeki dalga sayısı olarak tanımlanır  / = c olur.

5. Işığın ENERJİSİ • Birimleri ifade ederken kullanılabilecek ön ekler 1 Angström = 10-10 m Problem: 525 nmdekikırmızıışığınenerjisinibulunuz? E = h (c / ) = 6.62 10–27 x (3.0 x 1010 / 525 x 10–7) = 3.78 x 10–12erg

6. Işığın ELEKTROMANYETİK SPEKTRUMU

7. Spektroskopi çeşitleri X → X* → X uyarılmış halin ömrü 10-8sn

8. MOLEKÜLER ENERJİ SEVİYELERİ 1. Elektronikenerjiseviyeleri (en yüksek enerji seviyeleridir) 2. Vibrasyonel (titreşim) enerjiseviyeleri (atomlarınbağeksenleriboyuncadüzlemiçivedışıhareketleriilemeydanagelir) 3. Rotasyonel(dönme) enerjiseviyeleri (molekülündönmesiileoluşanenerjiseviyeleridir) 4. Translasyon(ötelenme) enerjiseviyeleri (molekülünbütünününyerdeğiştirmesiilemeydanagelenenerjiseviyeleridirveçokzayıfenerjilerdir) dir.

9. MOLEKÜLER ENERJİ SEVİYELERİ Enerjilerininbüyüklüğüaçısındanbuenerjiseviyelerişöylesıralanır: ElektronikVibrasyonelRotasyonelTranslasyon Elektronikenerjiseviyesienyüksekenerjiliolanıdırvebunedenleelektronlarınuyarılmasıiçinverilecekbirenerjiilediğerenerjiseviyelerinde de değişiklikolur.

10. MOLEKÜLER ENERJİ SEVİYELERİ I de rotasyonel, II de rotasyonel-vibrasyonel ve III de ise elektronik-vibrasyonel-rotasyonel enerji geçişleri şematize edilmiştir.

11. ELEKTRONİK GEÇİŞLER Molekülerspektroskopideuyarılacakolanelektronlarikişekildebulunurlar: a) Bağlarda:  (sigma) veya (pi) bağlarında b) Ortaklanmamışelektronçiftleriolarak(n) (* ve*, veninuyarılmışseviyeleridir)

12. ELEKTRONİK GEÇİŞLER  → * aşağı yukarı 160 nm civarındagerçekleşir ki bu enerjiuzak UV bölgesinedüşer. Enerjisi yüksek olan bu bölgede ışımaancakvakumdaeldeedilebilir. Bu nedenleuzak UV aynızamandavakum UV olarakda adlandırılır. İhtimalienyüksekolangeçişler: • →* (Ɛ= 103 – 105) ve • n →* (Ɛ < 103) geçişleridir. Vebugeçişler UV vegörünüralandagörülebilir. • →* geçişihtimalininyüksekolması p orbitallerininaynıeksenüzerindeolmasındandır. • Halbuki n →* geçişisırasında n orbitalleriileuyarılmış p orbitalleriarasındaaçısalfarklılıkvardır. Ɛ = Molarabsorptivite

13. Asetonmolekülünde: yukarıdasayılan 3 geçiş de mümkündür:

14. ELEKTRONİK GEÇİŞ – Moleküler yapı ilişkisi Ɛ ’un 10.000 – 20.000 basit α, β doymamışketonveyadienleri 1.000 – 10.000 moleküliçerisindebirkromatiksisteminvarlığınıgösterir. Aromatik birhalkayasubstitüenlerbağlanıncaƐdeğeri 10.000 ninüzerineçıkaramabazen 10.000 ninaltındakaldığı da olur. Ɛ‘nun 1000 den küçükoluşu n → * geçişlerinekarşılıkgelir.

15. ELEKTRONİK GEÇİŞ – Moleküler yapı ilişkisi • 270 – 350 nm lerarasındaçokdüşükşiddetteabsorpsiyonbantlarıvarsave  200 nm ninüzerindebaşkabirabsorpsiyonyoksabunelektronuiçerenbasitkonjugeolmamışbirbileşiğigösterir. • Bu zayıfbantlar n → * geçişlerinekarşılıkgelir. Eğerbirbileşikiçinspektrumundaçoksayıdabantvarsahattabazılarıgörünüralandaisebuuzunzincirlikonjugeveyapolisiklikaromatikkromoforugösterir. • Eğerbileşikrenkliiseyapısında en az 4 veya 5 konjugekromoforveoksokromgrubuvardır.

16. Bazı bileşiklerin molar absorptiviteleri

17. Spektrofotometride kullanılan bazı terimler: • λmaks= maksimumabsorpsiyonunolduğudalgaboyudur. • Kromoforgrup= Molekülün ışığı absorbe eden grupları Örneğin C=C, C=O, C=N gibi. Kromoforgruplarınıiçerenbileşiklerekromojenadıverilir. • Oksokromgrubu= kromoforüzerinde, soğurmanındalgaboyunuveşiddetinideğiştirensübstituenttir. Geneldeoksokrom, 200 nm den dahayüksekdalgaboylarındaabsorpsiyonyapmayanbirfonksiyonelgruptur (–OH, –NH2, –SH, –X gibi).

18. Absorpsiyonunoksokromvarlığındaartması (yanikojugasyonunartması) veyaçözücüdeğişmesindendolayıdahayüksekdalgaboylarınakaymasına “batokromiketki(kırmızıyakayma)“, konjugasyonunazalmasıveyaçözücüdeğişmesindendolayıdahadüşükdalgaboylarınakaymasına “hipsokromiketki (maviyekayma)“ adıverilir. • Hiperkromiketki= Absorpsiyonşiddetininartması, • Hipokromiketki = Absorpsiyonşiddetininazalmasıdemektir.

19. Bazı kromoforların absorpsiyon şiddetleri

20. Konjugasyon= Birmoleküliçerisindedeğişikgruplaraaitelektronlarınmolekülünyenimeydanagelenorbitallerinegeçerekbirarayagelmesidir. • Böylecedahaöncegruplaraaitolaraklokalizeolmuşelektronlarartıkdelokalizeolurlarvetümmoleküleaitolarakdahagenişbirhacimdebulunurlar. • Böylecedahakolayuyarılabilirhalegelirler. Konjugasyonderecesiarttıkçaelektronlardahaazenerjiileuyarılabilirler.

21. Örneğin; EtilenButadienHekzatrien 1 çiftbağvar 2 çiftbağvar 3 çiftbağvar Pik dalgaboyu : 193 nm 217 nm 258 nm Benzen Naftalin Antrasen

22. UV (ULTRAVİYOLE = MOR ÖTESİ) VE GÖRÜNÜR ALAN SPEKTROFOTOMETRİ • UV vegörünüralandakiışıkilemeydanagelenuyarılmasonucundaoluşanolaylarıkapsar. • 200-400 nmarasındakibölgeUV bölgesi • 400-800 nmarasındakibölgeiseGörünüralanolarakadlandırılır. • Her molekül farklı elektronik, vibrasyonel, rotasyonel ve translasyon geçiş enerjilerine sahip olduğu için kendi yapısına özgü enerjileri absorplar. Temel geçiş elektronik seviyeler olsa da düşük enerjili diğer geçişlerde elektronik geçişle birlikte absorpsiyonda rol alırlar.

23. UV vegörünüralanspektroskopisindedalgaboyunakarşıabsorpsiyonungrafiğegeçirilmesiilesüreklispektrum (bant spektrumumeydanagelir. Süreklispektrumda; moleküliçerisindekitümelektronikvediğergeçişlereaitçizgilerbirarayagelmişvebunlarıntoplamıolanbirçizgidizisimeydanagelmiştir. Bir sürekli spektrum

24. Pratiktespektrofotometrelerdedalgaboyunakarşılıkabsorbansdeğerlerininçizdirildiğigrafiklerespektrumadıverilirkibunlarsüreklispektrumdur. Dienogest‘in metanol – su (3:1) içindeki çözeltisinin UV spektrumu

25. Görünüralandakielektromanyetikradyasyongözümüze renk olarakgörünürve 400 – 800 nmarasındakibölgeyikapsar. Bualandakiışıkenerjisi de yinemoleküldeelektronlarınuyarılmasınanedenolabilecekkadargüçlüdür. Gözümüzegörünenrenklerbeyazışıktanabsorbeedilenlerdenkalanışınlarıntoplamıdır. Bunarenklerintamamlayıcılarıdenir. Tablodarenklervedalgaboylarıgörülmektedir. Örneğin500 nmcivarındaışıkabsorpsiyonuyapanbirçözeltininrengikırmızıdır. Renklerin tamamlayıcıları

26. Spektrofotometride kullanılan diğer bazı terimler: • Transmittans(geçirgenlik): “T”ilegösterilirvenumuneçözeltisindençıkanışığınşiddetinin (I) numuneçözeltisiüzerinegönderilenışığınşiddetine (Io) oranıdır: Yanigelenışığın ne kadarınındiğertarafageçtiğinigösterir. Alacağıdeğerler% 0 – 100arasındaolurvebuşekildeifadeedildiğinde% transmittansveya% geçirgenlikolarakadlandırılır.

27. 2) Absorbans: “A”ilegösterilirvenumuneçözeltisiüzerinegönderilenışığınşiddetinin (Io) çözeltidençıkanışığınşiddetine (I) oranınınlogaritmasıdır. Yani: Absorbans, numuneüzerinegönderilenışığın ne kadarınınabsorplandığınınölçüsüdür. Alacağıdeğerlerklasikspektrofotometrelerde (transmittans’ın % 0 – 100 arasında % 1’er değeraralıklarındaokunabildiği) 0 – 2arasındadır. Spektrofotometreninhassasiyetiarttıkçabuaralıkdagenişleyecektir. Örneğin; % 0.1 transmittansıölçebilenbirspektrofotometredebuaralık 0 – 3 olacaktır.

28. Transmittans varken acaba neden Absorbans terimi kullanılmaya başlanmıştır?: Bunun nedeni konsantrasyon ile transmittans arasındaki ilişkinin bir eğri olmasına karşılık konsantrasyon ile absorbans arasındaki ilişkinin doğrusal olmasıdır ve elde edilen doğrunun denkleminden (y=mx+n) yararlanılarak konsantrasyon hesapları daha kolay yapılabilir.

29. Örneğin: Absorbansı 0.800 olanbirçözeltinintransmittansıkaçtır? A = – log T 0.800 = – log T – 0.800 = log T T = antilog –0.800 T = 0.1584 yani% 15.84dür.

30. Lambert-Beer kanunu: Lambertışığın absorpsiyonu (A) α ışığın numune içerisinde almış olduğu yol (l) Beerışığın absorpsiyonu (A) α numunenin konsantrasyonu (C) Lambert-Beer eşitliği: A = k . l . C absorpsiyon katsayısı

31. Lambert-Beer kanunu: • A = Ɛ . l . C (molarabsorptivite; mol/L) • A = a . l . C (absorptivite; g/L) Absorptivitemaddenincinsinevedalgaboyunabağlıdır

32. Örnek; Molekül ağırlığı 250 g olanbirmaddenin 200 mg‘ısudaçözülüphacim 100 mLyetamamlanıyorvebuçözeltinin 254 nmdekiabsorbansı 0.320 olarakokunuyor. Bumaddenin 254 nmdeki molar absorptivitesinibulunuz? 100 mL de 200 mg çözünmüşse, 1000 mL de 2000 mg‘ı (2 g‘ı) çözünmüştür. Bu da: 2 / 250 = 0.008 M çözeltidemektir. A = Ɛ . l . C dir. 0.320 = Ɛ . l . 0,008 (herhangibirdeğerverilmiyorsa l = 1 cm dir) Ɛ = 40olarakbulunur.

33. Lambert-Beer kuralı aşağıdaki durumlarda geçerliliğini yitirir: • Lambert-Beer kuralıancak seyreltik çözeltilerde geçerlidir. Konsantre çözeltilerde komşu moleküller arasındaki elektrostatik etkileşmeler nedeniyle sapmalar gözlenir. Bunlardan en önemlisi incelenen madde ile çözücü arasında hidrojen bağları olması halidir. Çünkü hidrojen bağları olursa spektrum değişir. Örneğin 0.01M alkolün spektrumunda λmaks362 nm de iken 1M olduğundaλmaks 332 nm’ ye kayar. Nedenikonsantrasyonarttıkçaaralarındameydanagelenhidrojenbağlarınınartmasıdır. b) Numuneiçerisindekipartiküllernedeniylesaçılmavarsa, c) Numunedefloresansveyafosforesansvarsa, d) Yüksekanalit (analizedilenmadde) konsantrasyonlarındakırılmaindisindedeğişikliklermeydanageliyorsa, e) Konsantrasyonunfonksiyonuolarakkimyasaldengedekaymameydanageliyorsa, f) Monokromatikışıkkullanılmıyorsa (Monokromatik ışık: tek dalga boyundaki ışıktır)ve g) ParazitışıklarvarsaLambert-Beer kuralından sapmalar meydana gelir.

34. Ayrıca, çalışma esnasında analiz edilen maddelerin özellikleri değişiyorsa; örneğin ortamda kompleksleşme reaksiyonları varsa spektrumlarda değişmeler meydana gelir. Örneğinkobaltın suyla verdiği reaksiyon pembe renkli [Co(H2O)6]3+ oluşumu nedeniyledir. Amonyak ilave edilse renk koyu menekşe olur: [Co(H2O)5(NH3)]3+[Co(NH3)6]3+ (koyu menekşe).

35. Ortamın pH ‘ı da absorpsiyona etki eder: Cr2O72- (kırmızı) bazik ortamda CrO42- (sarı) haline döner ve spektrum değişir. Bu nedenle spektrofotometrik çalışmaları tampon çözeltiler içerisinde yapmak gerekir. • Ayrıca çalışma sırasında maddelerin oksidasyona uğramaları da spektrumu değiştirir. Örneğin mangan, redüktör ortamda Mn2+ şeklinde renksiz, oksidan ortamda Mn7+ şeklinde menekşe renklidir. • Keza fiziksel olaylar da spektrumu etkiler. Örneğin aseton, hekzanda çözülünce λmaks = 297 nm iken suda çözüldüğünde 264.5 nm’ ye kayar. Çünkü su ile aseton arasında hidrojen bağı meydana gelmesine karşılık hekzanda bu gözlenmez.

36. UV ve görünür alan spektroskopisinde elde edilen spektrumlardan aşağıdaki şekillerde yararlanılır: • Kalitatifanalizde: Çünkü her maddeninbellibirçözücüiçerisindekispektrumukendineözgüdür. • Kantitatifanalizde: Çünküabsorpsiyon, maddemiktarıileorantılıdır (Beer kanunu) • Dengesabitinintayininde (Kave Kb) • Molekülağırlığıtayininde • Kinetikçalışmalarda • Fotometriktitrasyonlarda

37. UV ve görünür alan spektrofotometride miktar tayini işlemleri: Analitik amaçlarla çalışılırken UV ve görünür alan olarak 200 – 800 nm arası anlaşılır. UV alanındaki çalışmalarda 200 – 400 nm arasındaki yakın UV alanı kullanılır. UV ve görünür alan spektroskopisindemiktar tayini işlemlerindeçözeltilerile çalışılır.

38. Miktar tayini işlemleri genelde aşağıda anlatılan 2 şekilde yapılır: 1) Miktar tayini için öncelikle standart madde ile kalibrasyon eğrisihazırlanır. Bunun için değişen ve bilinen miktarlardaanalit içeren standart çözeltilerin absorbans değerleri okunur ve okunan absorbans değerleri konsantrasyona karşı grafiğe geçirilir. Bunun sonucunda bir doğru elde edilir.

39. Budoğrunun; y = mx + n şeklindebirdenklemivardır (y = absorbans, x = konsantrasyon, m = eğimve n = kesim dir). Analitinbilinmeyenkonsantrasyondakibirçözeltisininabsorbansıspektrofotometredeokunurvebudenklemdeyerinekonularakkonsantrasyonuhesaplanabilir.

40. 2) Bilinenbirkonsantrasyonda (C1) standartmaddeninabsorbansıokunur (A1).Bir de bilinmeyenkonsantrasyondaki (Cx) çözeltininabsorbansı (As) okunur. Sonra, Lambert-Beer kanununagöreyazılaneşitlikleroranlanır: A1 = Ɛ . l . C1 As =Ɛ . l . Cxve A1 / As = C1 / Cxolur. BuradabilinmeyenyalnızcaCx dir vekolayca hesaplanabilir. • Yukarıdasayılan 2 yöntem, ortamdatekbirmaddevarlığındaveyavarsadiğerlerininetkisininhiçolmadığıhallerdekullanılanyöntemlerdir.

41. Miktar tayini işlemleri sırasında dikkat edilmesi gereken konular: 1) Miktartayinianalizlerindeabsorbanslarınmaksimumabsorpsiyonunolduğudalgaboylarındaokunmasıtercihedilir. Bununnedeni; cihazdakiokumahatalarınınminimumaindirilmesidir.

42. Örneğin; Şekildegörüldüğügibi gauss eğrisişeklindekibirspektrumdaeşitΔλkadarhatalıokuyanbirspektrofotometrede (örneğin λ± 0.1 nm) λmakscivarındaki ΔA yaniabsorbansokumahatasıileeğrinineteklerindebirdalgaboyundakiaynı ΔA karşılaştırılacakolursaλmakscivarındaki ΔA nınçokküçükolduğu (ΔA1) bunakarşılıkdiğerinin (ΔA2) yüksekolduğugörülecektir. Dalga boyundaki okuma hatası

43. 2)Çalışmalar sırasında en az hata ile çalışabilmek için absorbans değerlerinin 0.200 – 0.800 arasında olması istenir. Bunun nedeni transmittans ölçümü üzerindeki mutlak hatanın etkisidir. Lambert – Beer kanununa göre: A = Ɛ . l . C – log T = Ɛ . l . C

44. eğer eşitliğin sol taraf tabii logaritmaya çevrilir diferansiyeli alınırsa:

45. ΔC/C, transmittansölçümlerinde ΔT kadarhatayapıldığındakonsantrasyonölçümlerindemeydanagelenbağılhatayıgösterir. Buhatanınminimumolduğutransmittansdeğeri 0.368 dir vebu 0.434 absorbansdeğerinekarşılıkgelir. Konsantrasyondeğerlerinde % 2 den küçükbağılhataylaölçümyapabilmekyaklaşık 0.200 – 0.800 absorbansdeğerleriarasında (T = % 70 - 15) mümkündür. BununlailgilideğerlerŞekildegörülmektedir. Absorbansdeğerlerinin 0.100 den dahadüşükolduğundahata % 2.5 danyüksekolmaktadır.

46. Toplanabilirlikkuralı: Belirli bir λ’da X maddesi Axabsorpsiyonu, Y maddesi ise Ayabsorpsiyonu yapıyor ise X ve Y maddelerinin aynı konsantrasyonlardaki karışımı Ax+ Ayabsorpsiyonu yapar. Örneğinamaddesi C1konsantrasyonunda 251 nm de 0.245 absorbansdeğerine, birbmaddesi C2 konsantrasyonunda 251 nm de 0.156 absorbansdeğerinesahipsebuikimaddenin C1 ve C2 konsantrasyonundaolarakkarışımında 251 nm de okunanabsorbansdeğeri 0.245 + 0.156 = 0.401 olur.

47. İzosbestiknokta: Spektrumlarınaynıabsorpsiyonkatsayısınasahipolduğudalgaboyudur. Genellikleortamın pH‘ ınabağlıolarakdeğişenspetrumlarda, spektrumlarınkesiştiğinoktaolarakgörülür. Konsantrasyondeğişimlerinde de görülebilir.

48. Çözücüetkisi: • n * geçişineaitbantlardaçözücüpolaritesiarttıkçahipsokromikkaymameydanagelir. Bununnedeni; polar çözücülerdebağyapmamışorbitallerinenerjisindehidrojenbağıkadarbirazalmayanedenolmasıve n * geçişinedahaçokenerjigerekmesidir. Bu özelliktenyararlanarakhidrojenbağlarınıngücü de hesaplanabilir. • Buna karşılık* geçişlerindeise polar çözücülerkullanıldığındabatokromikkaymalargörülür. Fenolveaminlergibibileşikler pH değişimlerinekarşıçokhassastırlar. Çünkübağyapmamışelektronlarilesistemlerielektronlarıarasındakietkileşim pH değişimlerinegöredeğişir.

49. UV-Görünür alan spektrofotometrinin karışım analizlerinde kullanılışı: 1) 2 libirkarışımınanalizindekullanılışı SafhallerindeŞekildegörüldüğügibispektrumlarasahipavebgibiikibileşeninspektrumununvarolduğubirdurumdayani λ1ve λ2gibibirisindebirmaddeninmaksimumuvarkendiğerininminimumasahipolduğudiğerindeisediğermaddeninmaksimumuvarkenonunminimumasahipolduğu 2 dalgaboyuvarsa (örneğinparasetamol + metokarbamolkarışımıgibi) butipikili birkarışımdakibileşenlerinaşağıdakieşitlikleryardımıylahiçbirayırmaişlemigerekmeksizinaynıandamiktartayinlerispektrofotometrikolarakyapılabilir.

50. Tayinde, Lambert-Beer eşitliğindenyararlanılır. • Bununiçinönceliklekarışımımeydanagetirenavebgibiikimaddeninsafhallerindebilinenkonsantrasyonlardakiçözeltilerinin (standartçözelti) ölçülenabsorbanslarındanyararlanılarak A = Ɛ . l . C eşitliğiyardımıyla λ1ve λ2 dalgaboylarındakiƐdeğerlerihesaplanır. • Dahasonra avebyiiçerenkarışımnumunesindeaveb ninmiktarınıtayinedebilmekiçintoplanabilirlikkuralına göre aşağıdakieşitliklerhazırlanır: λ1 de A1 = Ɛaλ1 . l . Ca + Ɛbλ1 . l . Cb λ2 de A2 = Ɛaλ2 . l . Ca + Ɛbλ2 . l . Cb eşitlikleri yazılabilir.