TRANSFECCIONES II Biología Molecular 2009 Viernes 22 mayo

1. TRANSFECCIONES II Biología Molecular 2009 Viernes 22 mayo

2. Interacción de proteínas:Doble híbrido en células de levaduras

3. pAD

4. pBD

5. Plásmidos reporteros

6. Interacción de proteínas:Doble híbrido en células de mamífero

7. pBIND

8. pACT

9. pG5/luc

10. Ejemplo de resultados

11. Enriquecimiento de transfectantes • Cell sorting Cotransfectando con vectores de expresión para GFP o proteínas de membrana que sean reconocidas por Ac-fluorescentes

12. Transfección estable • Por integración • Por recombinación homóloga • Como episoma • Requiere de un marcador de selección en el vector • Util para estudios que impliquen inducción de la expresión

14. Marcadores de selección eucariontes • Agent Action Marker Gene • Blasticidin S Inhiben síntesis BlasticidinS deaminase • Hygromycin B proteica Gen hyg o hph • Puromycin • G-418 Neomycin phosphotransferase • Zeocina Intercalante del DNA gen Sh ble, se une • MTX Inhibits DNA syn. Dihydrofolate reductase

15. Marcadores de selección • G418 (Geneticina) • Bloquea la traducción • La resistencia es la neomicina fosfotransferasa ( Neor ) • Para células de mamífero, plantas y levaduras • Zeocina - Antibiótico de la familia bleomicina - Cliva el DNA - El producto del gen ble se une e impide el pegado al DNA. -de amplio espectro (mamíferos, levaduras y bacterias)

16. Sistema reprimible por tetraciclina

17. Sistema inducible por tetraciclina

18. Vector de expresión del regulador

19. Vector de expresión del regulador

20. Vector de clonado del gen de interés

21. Vector de expresión para dos genes regulados por tet

22. Vector episomal

23. Sistema de recombinación homóloga • Flp-in Invitrogen: Recombinación sitio específica de Saccharomyces cerevisiae • Sitio FRT (Flp recombination target) • Recombinasa Flp

24. Vector que contiene el sitio FRT

25. Pasos de recombinación homóloga 1- Generar línea que posea el sitio FRT

26. Vector de clonado del gen de interés

27. Vector de clonado del gen de interés

28. Vector de expresión de la recombinasa

29. 2- Cotransfectar con vector con gen de interés y vector de expresión para recombinasa

30. Resultado

31. ----uaagc-- ggcaaau---- aaaaa --------auucg--------ccguuua---- Disminuir expresión de un gen • Ribozimas cDNA ribozima Clivado del mRNA blanco

32. Disminuir expresión de un gen • Antisentido 1-Oligonucleótido pequeño simple cadena (15 -25 bases) gttagccggggaagcaaat aaaaa ----------------caaucggccccuucguuua---- Degradación por RNAsa del híbrido RNA/DNA

33. aaaaaa 5’ 3’ 2- Síntesis de un RNA antisentido complementario al gen blanco. cDNA a’ b’ c’ mRNA a b c Degradación por RNAsa del híbrido RNA/RNA

34. Disminuir expresión de un gen

35. Síntesis in vitro • Síntesis química • Transcripción in vitro • Digestión de los dsRNA por RNase III/DICER Expression in vivo • Plásmidos • Templados para PCR (cassette de expresión siRNA) • Vectores virales

36. RNAi (siRNA) aaaaa ----------------caaucggccccuucguuua---- mRNA Síntesis RNAi guuagccggggaagcaaau auuugcuuccccggcuaac (30 a 50 nucleotidos) b) cDNA Procesados por la maquinaria celular (dicer…) Degradación por RNAsa Clivado del mRNA blanco

37. Estrategias siRNA

38. Expresión de siRNA in vivo Promotor/Enhancer • • Pol III (U6, H1) • • Pol II (CMV) Secuencia de terminación • Pol III: string of 3-5 T’s) Señal de poly(A) SV40 siRNA Templado Templado para cadenas sense , hairpin y antisense del siRNA

39. Vector siRNA

40. Vectores Plasmídicos Expresión transiente • No se trabaja con RNA • Produce gran cantidad de vector • Enriquecimiento de células transfectadas por sorting o selección Expresión Estable (marcadores de selección) • Produce líneas estables • Animales transgénicos

41. VectoresmúltiplessiRNA

42. VectoresmúltiplessiRNA

44. Control siRNA

46. Bibliotecas siRNA

47. Diseño del experimento

48. Diseño del experimento

49. Bibliotecas siRNA: ejemplo

50. Bibliotecas siRNA: ejemplo