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L’interférence ARN une nouvelle approche pour inhiber l'expression des gènes. Perspectives en cancérologie

L’interférence ARN une nouvelle approche pour inhiber l'expression des gènes. Perspectives en cancérologie. Odile.Filhol.Cochet@cea.fr INSERM EMI 104 CEA Grenoble. Comparaison entre différentes méthodes d’inhibition de gènes .

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L’interférence ARN une nouvelle approche pour inhiber l'expression des gènes. Perspectives en cancérologie

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  1. L’interférence ARNune nouvelle approche pour inhiber l'expression des gènes. Perspectives en cancérologie Odile.Filhol.Cochet@cea.fr INSERM EMI 104 CEA Grenoble

  2. Comparaison entre différentes méthodes d’inhibition de gènes. ---------------------------------------------------------------------- Méthodes Avantages Inconvénients ---------------------------------------------------------------------- Knock-out animal InhibitionComplète du gène Laborieux, cher, Des mutantslétaux peuvent empêcher le développement embryonnaire Petites molécules introduction facile Spécificité variable inhibitrices Travail de développement intensif Anti-sense DNA Facile Efficacité variable peu onéreux Spécificité variable Nécessite une transfection RNA interference Spécifique Knock-down (pas knock-out) Relativement facile Nécessite une transfection

  3. Hybridation AS+ARN puis degradation: Antisens (ssDNA): un autre mécanisme pour le blocage de l’expression des gènes 3 modes d’intervention des antisens dans la cellule: • dégradation par la RNaseH • arrêt de transcription • régulation de la maturation des ARN • (de: http://www.isispharm.com + Scherer et Nature 2003 21, p1457)

  4. La RNAissance • 1998, RNA interférence : inhibition post-transcriptionnelle de l’expression de gènes après introduction d’ARNdb (nématode) Fire et al. • 2001: siRNA dans des cellules de mammifères Elbashir et al. • En 2002, Science magazine élit les RNAi comme la plus grande avancée technologique de l’année 2003. • 2004, association de la génomique fonctionnelle et du RNAi en oncologie (Oncogene)

  5. L’ARNi: une nouvelle star biotechnologique Principe de l’interférence ARN: Spécificité de la dégradation RISC (RNA-induiced sillencing complex)

  6. Prêt à agir après phosphorylation Découpés par DICER en siRNA Origines de siRNA • siRNA (synthèse chimique) • RNAi (viral) • shRNA (small hairpin) Produit à partir de plasmides • miRNA (micro : in vivo)

  7. Mode d’action de l’interférence

  8. Design de siRNA Critères d’efficacité: >90% de réduction du niveau de la protéine. [siRNA] de 1 à 20 nM Éviter les régions 3’ et 5’ non codantes du gène.

  9. Choix d’une séquence siRNA • Copier une séquence de 21 nt ayant les bons critères • S’assurer que cette séquence est spécifique du gène à cibler (BLAST) • Commander la séquence et son contrôle sous forme: - ARN synthétique - ADN NB:Il faut choisir au moins 3 siRNA pour cibler un gène.

  10. -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- • Méthodes de production des siRNA. • ------------------------------------------------------------------------- • MéthodesAvantages Inconvénients • ------------------------------------------------------------------------- • Synthèse Rapide RNAi Transitoire • Chimique Nécessite une transfection • Chimique: grande purité Chimique: cher • DNA (vecteur ou casette) moins cher Très laborieux • RNAi stable possible Nécessite une transfection • Vecteur viral RNAi stable Très laborieux • Utilisable pour des cellules Potentiellement dangereux résistantes aux transfections • par dsRNA/plasmides

  11. Comment introduire le siRNA dans une cellule de mammifère? • Par transfection de l’ARN ou de l’ADN (différents agents lipophiles) • Par électroporation • Par infection virale (adenoV*; retroV; lentiV) Comment introduire le siRNA dans un animal? • Par électroporation • par injection intra péritonéale • Par injection intraveineuse (apolipoprotéine B)

  12. shRNA transgénique • génération of knockdown pour des lignées ES • ‘Transgenic RNA interference in ES cell-derived embryos recapitulates a genetic null phenotype’ (May 2003, 21, 5 pp 559 - 561), Nature: Kunath et al. • Exemple: production stable de shRNA du gène p120-Ras GTPase-activating protein (RasGAP) • Il est possible de concentrer sur un seul allèle: grand intérêt en génétique (dirigé contre une mutation dominante, exemple le gène Tau dans les troubles neurologiques)

  13. Comment quantifier l’effet RNAi? • Au niveau de l’ARNm • Par Northern blot • Par RT-PCR Au niveaude la protéine • Par Western Blot • Par immunofluorescence • Par cytométrie en flux • Par des tests phénotypiques ou fonctionnels

  14. Applications • Génétique inverse (découvrir la fonction inconnue d’un gène connu). • Combinaison de l’interférence ARN et de la génomique (découvrir des gènes inconnus à partir d’un phénotype connu).

  15. Inhibition par RNAi de l’infection par HIV-1 delymphocytes T humains Approche combinatoire

  16. Applications • Génétique inverse (découvrir la fonction inconnue d’un gène connu). • Combinaison de l’interférence ARN et de la génomique (découvrir des gènes inconnus à partir d’un phénotype connu). Banques de siRNA.

  17. Préparation d’une banque de siRNA

  18. Le premier criblage RNAi • Stanford's Pat Brown looking at RNAi in genomewide expression profiling PNAS's May 27 (2003) p1073. Depuis,quelques publications… La difficulté de créer de bonnes banques de siRNA, puis d’avoir un phénotype facile à mesurer sur des cellules cultivées et tranfectées au format de criblage à haut débit, explique la faible abondance de publications dans le domaine.

  19. Perspectives de thérapie anticancéreuse par ARN interférence • Ciblage de molécules impliquées en carcinogenèse * voies d’oncogenèse (PTK, APC, PI3K HIF-1…) * Régulateurs du cycle cellulaire (RB, P53, cyclines…) * Apoptose (BCL2…) * sénescence (télomérase) * Stabilité et dégradation des protéines (cathépsine L)

  20. Perspectives de thérapie anticancéreuse par ARN interférence • Ciblage de gènes impliqués dans les interactions hôte-tumeur • Gènes importants pour l’angiogenèse (VEGF, angiogènine… • Gènes importants pour la dégradation de la matrice extracellulaire (u-PA • Gènes importants pour l’invasion et les métastases • Gènes de l’adhésion cellulaire

  21. Perspectives de thérapie anticancéreuse par ARN interférence • Ciblage de gènes important pour la résistance tumorale à la chimio et/ou radiothérapie • Gènes MDR • Molécules liées aux mécanismes de réparation de l’ADN ERCC1…

  22. Biblio • RNA interference collection Nature reviews Mai 2005 www.nature.com/reviews/focus/rnai • Prospects of RNA interference therapy for cancer gene therapy 2006 0 1-13 www.nature.com/gt

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