Laurea Specialistica in Biologia Cellulare e Molecolare Bioinformatica

1. Laurea Specialistica in Biologia Cellulare e MolecolareBioinformatica RNA non codificanti ed RNA regolatori Alessandro Laganà 20 maggio 2008

2. RNA non codificanti ed RNA regolatori • Piccoli RNA non codificanti • RNA regolatore • microRNA • RNAi e siRNA

3. Piccoli RNA non codificanti • Gli RNA non codificanti (ncRNA) giocano un ruolo fondamentale nei sistemi biologici complessi, pur non codificando alcuna proteina. • Tra i ncRNA maggiormente caratterizzati troviamo i tRNA (RNA transfer) e gli rRNA (RNA ribosomiali). • Recenti studi hanno però rivelato diverse altre classi di ncRNA, aventi funzioni catalitiche e strutturali. • Questi RNA sono componenti essenziali di complessi riboproteici (RNP), all’interno dei quali svolgono il ruolo di guida e riconoscimento di sequenze nucleotidiche target attraverso il meccanismo di complementarità delle basi.

4. Alcuni tipi di ncRNA • snoRNA (Piccoli RNA nucleolari): sono implicati nel processamento e nella maturazione degli RNA ribosomali e di altri tipi di RNA, aumentandone l’attività. • miRNA e siRNA: sono piccoli RNA in grado di regolare l’espressione genica a livello post-trascrizionale, silenziando specifiche molecole di mRNA. • piRNA: sono coinvolti nel silenziamento trascrizionale dei retrotrasposoni nelle cellule germinali.

5. RNA non codificanti ed RNA regolatori • Piccoli RNA non codificanti • RNA regolatore • microRNA • RNAi e siRNA

6. Regolazione genica post-trascrizionale • L’espressione genica può essere regolata a livello post-trascrizionale. • Non è detto che tutto l’mRNA che viene trascritto a partire da un certo gene venga utilizzato per sintetizzare la relativa proteina. Trascrizione Traduzione

7. RNA regolatore • La regolazione post-trascrizionale dell’espressione genica avviene per mezzo di molecole di RNA regolatore. • L’RNA regolatore è una molecola di RNA in grado di legarsi ad una molecola di mRNA impedendone la traduzione. • L’RNA regolatore riconosce il suo bersaglio in base al principio di appaiamento complementare delle basi. • Gli RNA regolatori sono solitamente piccole molecole di RNA con una certa struttura secondaria, ma con una regione a singolo filamento complementare ad una regione a singolo filamento dell’mRNA bersaglio. • Nella regolazione basata su small RNA è importante anche la struttura secondaria della molecola di RNA target.

8. RNA regolatore e inibizione della traduzione • L’appaiamento di una molecola di RNA regolatore ad una regione a singolo filamento di mRNA può provocare: • L’inibizione della traduzione senza distruzione della molecola di mRNA • La degradazione della molecola di mRNA • In entrambi i casi si ha il “silenziamento” del gene, il cui effetto è la mancata produzione della proteina corrispondente. • Perché un RNA regolatore possa legarsi ad una molecola di mRNA bersaglio: • La regione di legame sul bersaglio deve essere accessibile, ovvero meno stabile (deve contenere una regione, anche piccola, a singolo filamento). • Il legame con l’RNA regolatore deve essere energeticamente favorevole. Accessibile Non accessibile

9. RNA antisenso • Un gene antisenso codifica per un RNA la cui sequenza è complementare a quella di un RNA bersaglio: Target RNA 5’-AGGACTACCGACTAGCATA-3’ 3’-TCCTGATGGCTGATCGTAT-5’ Antisense RNA • A volte il gene antisenso si trova sul filamento opposto a quello del gene bersaglio, pertanto i due RNA saranno perfettamente complementari. • Altre volte gli RNA antisenso vengono trascritti da altre regioni del genoma, per cui si potrebbe avere una parziale complementarità delle loro basi.

10. RNA non codificanti ed RNA regolatori • Piccoli RNA non codificanti • RNA regolatore • microRNA • RNAi e siRNA

11. I microRNA • I microRNA (miRNA) sono piccole molecole di RNA in grado di regolare negativamente l’espressione di geni target a livello post-trascrizionale. • Sono dei piccoli RNA antisenso che mostrano complementarità parziale (quasi sempre) o totale (più raramente) delle loro basi rispetto a quelle dei loro mRNA bersaglio. • I miRNA sono in grado di impedire la traduzione dei loro target preservandone la stabilità o provocandone la distruzione. • Un miRNA può avere più target ed uno stesso mRNA può essere target di diversi miRNA.

12. Biogenesi dei miRNA • I trascritti primari dei geni miRNA sono chiamati pri-miRNA. • I pri-miRNA vengono tagliati da un enzima chiamato Drosha in molecole più piccole, a doppio filamento, chiamate pre-miRNA. • I pre-miRNA vengono esportati nel citoplasma e tagliati in RNA doppio filamento più piccoli da un altro enzima chiamato Dicer. • Uno dei due filamenti contiene il miRNA maturo, lungo solitamente tra i 19 e i 25 nucleotidi, che viene incorporato in un complesso proteico chiamato RISC.

13. miRNA • I miRNA nei RISC sono in grado di legarsi a siti specifici di mRNA provocandone il silenziamento: • L’appaiamento della sequenza del miRNA con il suo sito bersaglio non è perfetto, ma può contenere bulge e loop. • Dalle coppie miRNA/target individuate sperimentalmente emergono alcune regolarità nelle modalità di appaiamento.

14. Osservazioni sulle modalità di appaiamento • La regione iniziale (5’) del miRNA è chiamata seed e sembra essere la regione più importante nel silenziamento. • E’ lunga solitamente tra i 7 e i 10 nucleotidi, ma esistono casi di seed più corti o più lunghi. • Tale regione è solitamente appaiata in modo perfettamente complementare al suo target: • Il primo nucleotide del miRNA non è determinante e può non essere appaiato.

15. Osservazioni sulle modalità di appaiamento • La regione a valle del seed contiene solitamente un bulge o un loop: • La regione 3’ del miRNA mostra solitamente una complementarità imperfetta al suo target. • Le coppie G:U nella regione del seed sembrano essere sfavorevoli al silenziamento, sebbene siano ammesse, mentre sono abbastanza comuni nella regione 3’. • Infine, le regioni di legame dei miRNA si trovano nella regione 3’ UTR degli mRNA bersaglio.

16. Funzioni dei miRNA • I miRNA svolgono un ruolo centrale nel controllo di numerosi processi fisiologici: • Sviluppo • Differenziamento cellulare • Apoptosi • Aberrazioni nella loro espressione (mancanza, sotto o sovra espressione) sono correlate a diversi tipi di patologie: • Cancro • Malattie neurodegenerative • Malattie cardiache • Si tratta dunque di molecole molto importanti, il cui studio è fondamentale nella comprensione dei processi biologici, dei fenotipi patologici e, di conseguenza, nel design di terapie innovative.

17. miRBase • miRBase è la banca dati ufficiale dei miRNA: http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/ • Contiene le sequenze dei miRNA maturi e degli stem-loop precursori, oltre a riferimenti bibliografici ed informazione sui target.

18. miRBase • Cliccando su Browse si può sfogliare l’intero database organizzato per specie:

19. miRBase • Per ogni miRNA sono riportati: Lo stem-loop… …ed il miRNA maturo

20. Un problema bioinformatico: la ricerca di target per i miRNA • Sebbene si conoscano già quasi 500 miRNA nell’uomo (e molti altri in altre specie), solo per il 10% di essi è stato individuato almeno un target. • Problema: • Dato un miRNA, determinare i suoi possibili mRNA target • Esistono numerosi tool su web che offrono servizi di predizione di target per miRNA: • TargetScan • PicTar • miRanda • … • Molti di essi offrono dei database di predizioni già effettuate da consultare.

21. RNA non codificanti ed RNA regolatori • Piccoli RNA non codificanti • RNA regolatore • microRNA • RNAi e siRNA

22. I siRNA • I siRNA sono piccole molecole di RNA simili ai miRNA. • Non sono codificati da sequenze genomiche ma derivano da altre molecole di RNA più grandi, spesso di origine esogena (es. virus). • Come i miRNA vengono tagliati dal Dicer ed incorporati nel RISC. • Si appaiano con complementarità totale a siti specifici sui loro target (in CDS o UTR) provocandone la degradazione.

23. siRNA ed RNA Interference • I siRNA sono le principali molecole utilizzate nell’RNA Interference (RNAi) artificiale. • I siRNA vengono disegnati ad hoc sulla base del sito di legame scelto sul trascritto da silenziare ed hanno generalmente complementarità totale al loro target. • Le molecole di siRNA vengono solitamente introdotte nelle cellule mediante vettori virali, virus ingegnerizzati che trasportano l’informazione per la codifica dei siRNA nel loro genoma. • Un uso tipico dell’RNAi è il knock-out artificiale dei geni, ovvero il silenziamento dell’espressione di uno più geni per studiarne gli effetti e le conseguenze e di conseguenza le funzioni svolte.

24. RNA interference • Premio Nobel 2006 per la Medicina Craig Mello ed Andrew Fire